Cluster mast cell interactions in chronic endometritis in women with recurrent pregnancy loss

• Sergey A. Mikhalev
• Mark A. Kurtser
• Victor E. Radzinsky
• Atiakshin Dmitrii A.
• Mekan R. Orazov

Abstract

Chronic endometritis (CE) remains one of the most common causes of endometrial implantation failure. The morphological determinants of recurrent miscarriage (RM) include alterations in the local immune landscape, with the integration of mast cells (MCs) into the endometrium. However, the contribution of CE to the genesis of reproductive failures remains unclear and is the subject of intense debate.

The aim of the study was to expand the understanding of the pathogenesis of habitual miscarriage.

Material and methods. A prospective comparative study was performed on the basis of the City Clinical Hospital No. 31 named after Academician G.M. Savelyeva of the Moscow Department of Health. The main group included 53 patients of reproductive age with a history of recurrent miscarriage and histologically confirmed CE. The morphological control group consisted of endometrial biopsies from 10 fertile women without CE. We analyzed the quantitative and qualitative characteristics of the endometrial mast cell (MC) population depending on the severity of CE.

Results. It was confirmed that with mild CE, endometrial mast cells (MCs) are recruited and the proinflammatory mediator tryptase is released against the background of a verified morphological phenomenon of MC solocalization with CD8⁺ lymphocytes and CD163⁺ macrophages. In severe chronic endometriosis, increased extracellular matrix production and the appearance of dendritic structures due to modification of the structure of cellular elements are observed in areas of active cellular interaction. The significance of MC cooperation with CD8⁺ lymphocytes and CD163⁺ macrophages in the pathogenesis of fibrotic changes in the endometrium has been demonstrated for the first time.

Conclusion. The pathogenesis of habitual miscarriage is based on spatial patterns of MC integration into the endometrial immune landscape, resulting in the formation of multicomponent morphogenetic clusters, depending on the severity of chronic endometriosis. Morphological determinants of the multicluster environment, determined by complex spatial cellular relationships within the endometrium, have been established.

Keywords: mast cells; tryptase; endometritis; spatial phenotyping; mapping; intercellular interactions; fibrosis

Введение

Одной из нерешенных и нерешаемых доступными методами проблем репродуктивной медицины XXI в. является привычный выкидыш. Данная проблема дефинируется как наличие двух и более клинических потерь беременности в сроках до 22 нед гестации. Многогранность патофизио­логии хронического эндометрита (ХЭ), в которой нарушение регуляции локального иммунитета считается одним из ключевых звеньев в генезе неудач имплантации и определяет актуальность выбранной темы. Представление о роли тучных клеток (ТК) в генезе ХЭ основывается на том, что эта гетерогенная клеточная популяция, являющаяся ключевым компонентом врожденного иммунитета, участвует в формировании множества реакций организма, а также в развитии воспалительных, аутоиммунных и опухолевых заболеваний [1]. Участие ТК в иммуновоспалительных реакциях определяется их способностью синтезировать и секретировать множество биологически активных веществ. Эти вещества, взаимодействуя с другими клетками, играют ключевую роль в модуляции иммунных реакций - они влияют как на врожденный, так и на адаптивный иммунитет посредством межклеточной коммуникации [2, 3].

Эндометриальные ТК являются важными компонентами иммунного гомеостаза эндометрия и вносят особый вклад в реализацию циклической трансформации ткани [4]. Триптаза является наиболее распространенной секреторной гранулярной сериновой протеиназой, содержащейся в гранулах ТК, и расценивается как провоспалительный маркер, оптимальный для детекции объема всей популяции в ткани [5-7]. Обсуждается вовлеченность триптазы в процесс ангиогенеза [8, 9], который сочетается с ремоделированием соединительной ткани, секрецией факторов роста, цитокинов и хемокинов, матриксных металлопротеиназ [10]. Триптаза потенцирует развитие воспаления, взаимодействуя с рецепторами PAR-2 на различных фенотипах клеток тканевого микроокружения [10]. Дискутируются эпигенетические эффекты триптазы по отношению к клеткам-мишеням [11, 12]. Ферментативная активность триптазы в ядре клетки стабилизируется молекулами ДНК, позволяя длительно регулировать состояние гистонов [11, 12]. Данный принцип регуляции эпигенетической модификации гистонов в ядрах демонстрирует особые функциональные возможности триптазы ТК [12].

Несмотря на существенное углубление представлений о патогенетической роли ТК в течении иммуновоспалительных заболеваний, сохраняют актуальность исследования механизмов их активации и регуляции, особенностей взаимодействия медиаторов с иммунокомпетентными клетками, механизмов реализации провоспалительных эффектов при ХЭ.

Цель исследования - расширить представления о патогенезе привычного выкидыша.

Материал и методы

Проспективное обсервационное сравнительное исследование выполнено на базе ГБУЗ ГКБ № 31 им. акад. Г.М. Савельевой ДЗМ. Основную группу составили 53 пациентки репродуктивного возраста с привычным невынашиванием беременности (ПНБ) в анамнезе и гистологически верифицированным ХЭ. Группу морфологического контроля составили биоптаты эндометрия 10 фертильных женщин, без ХЭ. Выполнен анализ количественных и качественных характеристик популяции ТК эндометрия в зависимости от степени выраженности ХЭ.

Критерии включения: пациентки репродуктивного возраста с привычным выкидышем, наличие ХЭ, верифицированного патоморфологически и иммуногистохимически. Включенные в исследование пациентки подписали добровольное информированное согласие в соответствии с Хельсинской декларацией Всемирной медицинской ассоциации.

Критерии исключения: злокачественные новообразования органов репродуктивной системы, беременность и лактация, тяжелые соматические заболевания, сахарный диабет, первичные и вторичные иммунодефицитные состояния, кесарево сечение и миомэктомия в анамнезе.

Образцы эндометрия получали путем пайпель-биопсии, патоморфологическое исследование проводили в среднюю стадию фазы пролиферации (7-10-й день менструального цикла). Гистологическое исследование биоптатов эндометрия было проведено в соответствии с модифицированными критериями Нойеса.

Фрагменты эндометрия фиксировали в забуференном 4% формальдегиде и заливали в парафин. Парафиновые срезы ткани (толщиной 5 и 2 мкм для гистохимического и иммуногистохимического окрашивания соответственно) депарафинизировали ксилолом и регидратировали в соответствии со стандартным протоколом [13].

Для иммуногистохимического анализа проводили демаскировку антигена при температуре 95 °C (30 мин) в специализированном буфере R-UNIVERSAL (Aptum Biologics Ltd., Southampton, SO16 8AD, Великобритания). Блокирование эндогенных Fc-рецепторов перед инкубацией с первичными антителами (АТ) не проводилось в соответствии с практическими рекомендациями [14]. После блокады активности эндогенной пероксидазы (при необходимости) наносили первичные АТ в концентрации от 1 до 5 мкг/мл и инкубировали в течение ночи при температуре +4 °C. Визуализацию первичных АТ проводили c помощью вторичных АТ, конъюгированных с пероксидазой хрена (amplistain™ anti-mouse 1-step HRP или amplistain™ anti-rabbit 1-step HRP, SDT GmbH, Германия), и системы детекции DAB Peroxidase Substrat Kit (#SK-4100, Vector Laboratories, Burlingame, CA, США). При реализации дизайна иммуногистохимического окрашивания с одновременной детекцией нескольких молекулярных мишеней использовали вторичные АТ, конъюгированные с флуорохромами Alexa Fluor-488 (goat anti-rabbit IgG Ab, #ab150077) или Cy3 (goat anti-mouse IgG Ab, #ab97035), с итоговой концентрацией АТ от 5 до 10 мкг/мл PBS. Ядра контрастировали с помощью гематоксилина Майера (HK-G0-DL01, "Биовитрум") с последующим заключением срезов в постоянную монтажную среду или раствором DAPI (#D9542-5MG, Sigma) при использовании временной монтажной среды [Vectashield^® Mounting Medium (#H-1000), Vector Laboratories, Burlingame, CA, США].

Для определения иммунного и стромального ландшафта эндометрия использовали набор различных флуорохромов OPAL с системой мультиплексной визуализации Mantra 2 Quantitative Pathology Imaging System (Akoya Biosciences, США) на базе микроскопа Olympus BX43, оснащенного мульти­спектральной 12-битной монохромной высокочувствительной ПЗС-камерой научного класса с настраиваемым спектральным фильтром на жидких кристаллах.

Гистохимическое окрашивание толуидиновым синим, многокомпонентным раствором Гимзы и пикро Маллори, гематоксилином и эозином, а также импрегнация серебром проводили согласно инструкции производителя [14].

Для идентификации ХЭ использовали следующие морфологические критерии:

1. Слабо выраженный ХЭ (СВХЭ) характеризуется:

• отсутствием фиброза;
• площадью просвета артериол (Sпр, мкм²) в диапазоне 150≤Sпр≤449 мкм²;
• диаметром просвета артериол (Dпр, мкм) в пределах 10,0≤Dпр≤19,9 мкм;
• количеством CD138⁺-клеток не более 1.

2. Умеренно выраженный ХЭ (УВХЭ) определяется при наличии:

• фиброза;
• площади просвета артериол (Sпр, мкм²) в интер­вале 100≤Sпр≤149 мкм²;
• диаметра просвета артериол (Dпр, мкм) от 8,0 до 9,9 мкм;
• числа CD138⁺-клеток, равного 2 или 3.

3. Выраженный ХЭ (ВХЭ) диагностируется при следующих показателях:

• наличии фиброза;
• площади просвета артериол (Sпр, мкм²), не превышающей 99 мкм²;
• диаметре просвета артериол (Dпр, мкм), составляющем не более 7,9 мкм;
• количестве CD138-положительных клеток 4 и более.

Окрашенные срезы исследовали на моторизованном микроскопе ZEISS Axio Imager.Z2, используя для фото­документирования в том числе объективы Zeiss alpha Plan-Apochrom 100×/1,46 Oil DIC M27, Zeiss Plan-Apochrom 150×/1,35 Glyc DIC Corr M27 и цветную камеру ZEISS Axiocam 712. Полученные изображения обрабатывали с помощью программного обеспечения "Zen 3.0 Light Microscopy Software Package", "ZEN Module Bundle Intellesis & Analysis for Light Microscopy", "ZEN Module Z Stack Hardware" (Carl Zeiss Vision, Германия).

Картирование и визуализацию окрашенных срезов проводили после сканирования всего гистологического среза с использованием цифрового патологического сканера слайдов (флуоресцентного) KF-FL-005 (Нинбо, Чжэцзян, Китай), объектива ×40 ScanScope CS (Leica Biosystems, Дир Парк, Иллинойс, США). С целью количественного анализа клеток-мишеней на единицу площади эндометрия и определения абсолютного числа ТК был проведен планиметрический анализ в программном продукте QuPath [15]. Идентификацию ядер осуществляли с применением расширения Stardist [16]. Для сегментации структур или иммунопозитивных клеток-мишеней и их стратификации использовали встроенный в QuPath пиксельный классификатор.

Статистический анализ осуществляли с использованием пакета программ SPSS (версия 13.0, IBM, США). Результаты представлены в виде среднего значения (M) ± m (стандартная ошибка среднего). Для оценки значимости различий между 2 группами использовали t-критерий Стьюдента или U-критерий Манна-Уитни в случае непараметрического распределения. Статистическую значимость считали равной: p<0,05 -по сравнению с группой морфологического контроля, p<0,01 - по сравнению с группой морфологического контроля.

Результаты и обсуждение

В ходе исследования при ХЭ наблюдалась высокая степень солокализации ТК с CD14⁺-клетками эндометрия (рис. 1F), с различными типами клеточного взаимодействия - юкстакринным и паракринным (рис. 1A, G, N). Цитотопографический анализ верифицировал наличие контактов ТК с CD14⁺-клетками на участках цитоплазмы различной площади (рис. 1). Контакт с цитоплазматическими выростами ТК был идентифицирован как на небольшой площади моноцитов (рис. 1Е, F, K, O), так и на более протяженных участках с усилением выраженности эндометрита (рис. 1A’, B, С, M, P, Q, T). Отличием ХЭ было увеличение площади соприкосновения ТК с CD14⁺-клетками за счет отростчатых образований, а также локусов одномоментного контакта с несколькими клетками эндометрия (рис. 1H, I, L, O, Q, S). Выраженная интеграция ТК в локальные скопления CD14⁺-клеток создавала структуру, напоминающую мультиклеточную сеть - функциональный синцитий. Гистотопографические особенности были обусловлены локально ограниченной аккумуляцией, варьирующей в зависимости от степени выраженности ХЭ.

Исследование взаимной солокализации ТК и макрофагов М1-типа показало, что в цитоплазме ТК содержится значительное количество макросиалина (рис. 2Е). Выявлена корреляция экспрессии макросиалина в ТК со степенью выраженности эндометрита. Наибольший пул ТК, иммунопозитивных к CD68⁺, формировался при выраженном ХЭ (рис. 2В). Регистрировали высокую плотность контактирования ТК с М1 при менее выраженном воспалении (рис. 2С). Пространственное фенотипирование показало, что в биоптатах при умеренно выраженном и тяжелом ХЭ наибольшее количество CD68⁺-макрофагов локализовалось в фокусах с накоплением ТК (рис. 2F, I). В локусах скопления макрофагов ТК при СВХЭ встречались в минимальном количестве или отсутствовали. 3D-моделирование продемонстрировало отсутствие обширного таргетного взаимодействия ТК с макрофагами М1-типа (в отличие от моноцитов) на значительных участках цитоплазмы (рис. 2G, L). Юкстакринная локализация ТК характеризовалась небольшим локусом соприкосновения (рис. 2Н, J, K).

Исследование взаимодействия ТК с М2-типа показало максимальный профиль популяции CD163⁺-макрофагов при СВХЭ и снижение их содержания при ВХЭ (рис. 3B). Картирование ТК и М2 типа при каждом типе ХЭ показало варианты клеточной комбинаторики - от активного скопления CD163⁺-макрофагов с ТК до изолированных зон отдельных популяций (рис. 3Е-E’’). Локусы активного взаимодействия клеток (рис. 3G) встречались при ХЭ различной выраженности, с превалированием паракринного воздействия ТК на М2-типа (рис. 3С). Интеграция ТК в сеть макрофагов осуществлялась за счет цитоплазматических выростов, позволяющих контактировать с двумя и более CD163⁺-клетками (рис. 3G, H, I, J, L). При изучении персональной вариабельности данных гистотопографических особенностей на ТК были выявлены цитоплазматические выросты других клеток, иммунопозитивных к CD163⁺ (рис. 3F). Тесную площадь соприкосновения наблюдали при интеграции ТК в сеть М2-типа.

Активация ТК формирует высокую чувствительность к ряду компонентов специфического тканевого микроокружения и перестройку рецепторного аппарата с дальнейшей чрезмерной секрецией биогенных аминов, цитокинов и специфических протеаз с провоспалительной активностью [17, 18]. В нашем исследовании впервые выполнено профилирование функциональной архитектуры взаимодействия ТК с иммунокомпетентными клетками эндометрия и показаны ключевые механизмы участия триптазы в развитии интраорганного воспаления. Сложность коммуникативных взаимо­действий иммунных и клеточных факторов, включая стромальные и эпителиальные клетки, при ХЭ была представлена ранее [19]. Пространственные закономерности секреции триптазы при активации ТК отражают механизм развития хронического воспаления, выраженная активность которого неизбежно приводит к формированию профиброгенных ниш с избыточным образованием внеклеточного матрикса.

Полученные нами результаты подтверждают значимые изменения показателей при различной выраженности ХЭ, отражая взаимодействия ТК с другими субпопуляциями иммунных клеток тканевого микроокружения эндометрия. Эти факты доказывают эпигенетические механизмы развития биологических эффектов триптазы при юкста- и пара­кринном воздействии ТК на моноциты, макрофаги, лимфо­циты и другие клетки эндометрия. Обозначенный нами иммуномодулирующий механизм ТК включает пространственные признаки взаимодействия с другими клеточными популяциями врожденного и приобретенного иммунитета эндометрия, специфические при различной выраженности ХЭ. Аномальное повышение числа ТК при ПНБ также описано в других исследованиях [20].

Заключение

В основе патогенеза ПНБ лежат пространственные законо­мерности интеграции ТК в иммунный ландшафт эндометрия с образованием многокомпонентных морфогенетических кластеров, в зависимости от выраженности ХЭ. Установлены морфологические детерминанты мультикластерной среды, определяемой сложными пространственными клеточными взаимоотношениями эндометрия.

Referenses

1. Lee S.K., Kim C.J., Kim D.J., Kang J.H. Immune cells in the female reproductive tract. Immune Netw. 2015; 15 (1): 16–26. DOI: https://doi.org/10.4110/in.2015.15.1.16 Epub 2015 Feb 17. PMID: 25713505; PMCID: PMC4338264.

2. Elieh-Ali-Komi D., Shafaghat F., Alipoor S.D., Kazemi T., Atiakshin D., Pyatilova P., et al. Immunomodulatory significance of mast cell exosomes (MC-EXOs) in immune response coordination. Clin Rev Allergy Immunol. 2025; 68 (1): 20. DOI: https://doi.org/10.1007/s12016-025-09033-6 PMID: 39976807; PMCID: PMC11842441.

3. Marshall J.S., Warrington R., Watson W., Kim H.L. An introduction to immunology and immunopathology. Allergy Asthma Clin Immunol. 2018; 14 (suppl 2): 49. DOI: https://doi.org/10.1186/s13223-018-0278-1

4. Norrby K. On connective tissue mast cells as protectors of life, reproduction, and progeny. Int J Mol Sci. 2024; 25: 4499. DOI: https://doi.org/10.3390/ijms25084499

5. Atiakshin D., Morozov S., Dlin V., Kostin A., Volodkin A., Ignatyuk M., et al. Renal mast cell-specific proteases in the pathogenesis of tubulointerstitial fibrosis. J Histochem Cytochem. 2024; 72 (8–9): 495–515. DOI: https://doi.org/10.1369/00221554241274878 PMID: 39263893; PMCID: PMC11529666.

6. Atiakshin D., Patsap O., Kostin A., Mikhalеva L., Buchwalow I., Tiemann M. Mast cell tryptase and carboxypeptidase A3 in the formation of ovarian endometrioid cysts. Int J Mol Sci. 2023; 24 (7): 6498. DOI: https://doi.org/10.3390/ijms24076498 PMID: 37047472; PMCID: PMC10095096.

7. Ribatti D. Tryptase and tumor angiogenesis. Front Oncol. 2024 Dec 19; 14: 1500482. DOI: https://doi.org/10.3389/fonc.2024.1500482 PMID: 39749033; PMCID: PMC11693740.

8. Vitte J. Human mast cell tryptase in biology and medicine. Mol Immunol. 2015; 63 (1): 18–24.

9. Longo V., Tamma R., Brunetti O., Pisconti S., Argentiero A., Silvestris N., et al. Mast cells and angiogenesis in pancreatic ductal adenocarcinoma. Clin Exp Med. 2018; 18 (3): 319–23. DOI: https://doi.org/10.1007/s10238-018-0493-6 Epub 2018 Feb 28. PMID: 29492715.

10. Pejler G., Abrink M., Ringvall M., Wernersson S. Mast cell proteases. Adv Immunol. 2007; 95: 167–255. DOI: https://doi.org/10.1016/S0065-2776(07)95006-3 PMID: 17869614.

11. Melo F.R., Vita F., Berent-Maoz B., Levi-Schaffer F., Zabucchi G., Pejler G. Proteolytic histone modification by mast cell tryptase, a serglycin proteoglycan-dependent secretory granule protease. J Biol Chem. 2014; 289 (11): 7682–90. DOI: https://doi.org/10.1074/jbc.M113.546895 Epub 2014 Jan 29. PMID: 24478313; PMCID: PMC3953279.

12. Melo F.R., Wallerman O., Paivandy A., Calounova G., Gustafson A.M., Sabari B.R., et al. Tryptase-catalyzed core histone truncation: a novel epigenetic regulatory mechanism in mast cells. J Allergy Clin Immunol. 2017; 140 (2): 474–85. DOI: https://doi.org/10.1016/j.jaci.2016.11.044 Epub 2017 Jan 17. PMID: 28108335.

13. Melo F.R., Santosh Martin S., Sommerhoff C.P., Pejler G. Exosome-mediated uptake of mast cell tryptase into the nucleus of melanoma cells: a novel axis for regulating tumor cell proliferation and gene expression. Cell Death Dis. 2019; 10 (9): 659. DOI: https://doi.org/10.1038/s41419-019-1879-4 PMID: 31506436; PMCID: PMC6736983.

14. Alanazi S., Melo F.R., Pejler G. Tryptase regulates the epigenetic modification of core histones in mast cell leukemia cells. Front Immunol. 2021; 12: 804408. DOI: https://doi.org/10.3389/fimmu.2021.804408 PMID: 34925389; PMCID: PMC8674432.

15. Shamarakova M.V., Nizyaeva N.V., Bogdanova I.M., Boltovskaya M.N., Artemyeva K.A., Mikhaleva L.M. Rol’ tuchnykh kletok pri fiziologicheskoi i oslozhnennoi beremennosti [The role of mast cells in physiological and complicated pregnancy]. Arkh Patol. 2023; 85 (3): 75–81. DOI: https://doi.org/10.17116/patol20238503175 PMID: 37272444. (in Russian)

16. Niu W., Zhang Y., Liu H., Liang N., Xu L., Li Y., et al. Single-cell profiling uncovers the roles of endometrial fibrosis and microenvironmental changes in adenomyosis. J Inflamm Res. 2023; 16: 1949–65. DOI: https://doi.org/10.2147/JIR.S402734 PMID: 37179754; PMCID: PMC10167994.

17. Skarzynski D.J., Szóstek-Mioduchowska A.Z., Rebordão M.R., Jalali B.M., Piotrowska-Tomala K.K., Leciejewska N., et al. Neutrophils, monocytes and other immune components in the equine endometrium: friends or foes? Theriogenology. 2020; 150: 150–7. DOI: https://doi.org/10.1016/j.theriogenology.2020.01.018 Epub 2020 Jan 13. PMID: 31973963.

18. Zhang Z., Kurashima Y. Two sides of the coin: mast cells as a key regulator of allergy and acute/chronic inflammation. Cells. 2021; 10 (7): 1615. DOI: https://doi.org/10.3390/cells10071615 PMID: 34203383; PMCID: PMC8308013.

19. Mikhalev S.A., Kurtser M.A., Radzinsky V.E., Beeraka N.M., Kostin A.A., Atiakshin D.A., et al. Immune and extracellular matrix dynamics in chronic endometritis: insights into endometrial homeostasis and fibrogenic niche evolution. Int J Biomed. 2025; 15 (1): 119–28. DOI: https://doi.org/10.21103/Article15(1)_OA11

20. Derbala Y., Elazzamy H., Bilal M., Reed R., Salazar Garcia M.D., Skariah A., et al. Mast cell-induced immunopathology in recurrent pregnancy losses. Am J Reprod Immunol. 2019; 82: e13128. DOI: https://doi.org/10.1111/aji.13128

All articles in our journal are distributed under the CC BY-NC-ND 4.0 (Creative Commons Attribution-NonCommercial-NoDerivatives 4.0 International)