Кластерные взаимодействия тучных клеток при хроническом эндометрите у женщин с привычным невынашиванием беременности

• Михалев Сергей Александрович
• Курцер Марк Аркадьевич
• Радзинский Виктор Евсеевич
• Атякшин Дмитрий Андреевич
• Оразов Мекан Рахимбердыевич

Резюме

Хронический эндометрит (ХЭ) остается одной из наиболее частых причин имплантационной несостоятельности эндометрия. Морфологическими детерминантами привычного невынашивания беременности (ПНБ) служат изменения/нарушения локального иммунного ландшафта с интеграцией в эндометрий тучных клеток (ТК), однако вклад ХЭ в генез репродуктивных неудач остается до конца неясным и служит предметом острых дискуссий.

Цель исследования - расширить представления о патогенезе привычного выкидыша.

Материал и методы. Выполнено проспективное сравнительное исследование на базе ГБУЗ ГКБ № 31 им. акад. Г.М. Савельевой ДЗМ. Основную группу составили 53 пациентки репродуктивного возраста с ПНБ в анамнезе и гистологически верифицированным ХЭ. Группу морфологического контроля составили биоптаты эндометрия 10 фертильных женщин без ХЭ. Выполнен анализ количественных и качественных характеристик популяции ТК эндометрия в зависимости от степени выраженности ХЭ.

Результаты. Подтверждено, что при слабо выраженном ХЭ наблюдается рекрутирование ТК эндометрия и выделение провоспалительного медиатора триптазы на фоне верифицированного морфологического феномена солокализации ТК с CD8⁺-лимфоцитами и CD163⁺-макрофагами. При выраженном ХЭ в локусах активного клеточного взаимодействия наблюдается усиление продукции внеклеточного матрикса и появления отростчатых образований за счет модификации структуры клеточных элементов. Впервые показана значимость кооперации ТК с CD8⁺-лимфоцитами и CD163⁺-макрофагами в патогенезе фиброзных изменений эндометрия.

Заключение. В основе патогенеза ПНБ лежат пространственные закономерности интеграции ТК в иммунный ландшафт эндометрия с образованием многокомпонентных морфогенетических кластеров в зависимости от выраженности ХЭ. Установлены морфологические детерминанты мультикластерной среды, определяемой сложными пространственными клеточными взаимоотношениями эндометрия.

Ключевые слова: тучные клетки; триптаза; эндометрит; пространственное фенотипирование; картирование; межклеточное взаимодействие; фиброз

Введение

Одной из нерешенных и нерешаемых доступными методами проблем репродуктивной медицины XXI в. является привычный выкидыш. Данная проблема дефинируется как наличие двух и более клинических потерь беременности в сроках до 22 нед гестации. Многогранность патофизио­логии хронического эндометрита (ХЭ), в которой нарушение регуляции локального иммунитета считается одним из ключевых звеньев в генезе неудач имплантации и определяет актуальность выбранной темы. Представление о роли тучных клеток (ТК) в генезе ХЭ основывается на том, что эта гетерогенная клеточная популяция, являющаяся ключевым компонентом врожденного иммунитета, участвует в формировании множества реакций организма, а также в развитии воспалительных, аутоиммунных и опухолевых заболеваний [1]. Участие ТК в иммуновоспалительных реакциях определяется их способностью синтезировать и секретировать множество биологически активных веществ. Эти вещества, взаимодействуя с другими клетками, играют ключевую роль в модуляции иммунных реакций - они влияют как на врожденный, так и на адаптивный иммунитет посредством межклеточной коммуникации [2, 3].

Эндометриальные ТК являются важными компонентами иммунного гомеостаза эндометрия и вносят особый вклад в реализацию циклической трансформации ткани [4]. Триптаза является наиболее распространенной секреторной гранулярной сериновой протеиназой, содержащейся в гранулах ТК, и расценивается как провоспалительный маркер, оптимальный для детекции объема всей популяции в ткани [5-7]. Обсуждается вовлеченность триптазы в процесс ангиогенеза [8, 9], который сочетается с ремоделированием соединительной ткани, секрецией факторов роста, цитокинов и хемокинов, матриксных металлопротеиназ [10]. Триптаза потенцирует развитие воспаления, взаимодействуя с рецепторами PAR-2 на различных фенотипах клеток тканевого микроокружения [10]. Дискутируются эпигенетические эффекты триптазы по отношению к клеткам-мишеням [11, 12]. Ферментативная активность триптазы в ядре клетки стабилизируется молекулами ДНК, позволяя длительно регулировать состояние гистонов [11, 12]. Данный принцип регуляции эпигенетической модификации гистонов в ядрах демонстрирует особые функциональные возможности триптазы ТК [12].

Несмотря на существенное углубление представлений о патогенетической роли ТК в течении иммуновоспалительных заболеваний, сохраняют актуальность исследования механизмов их активации и регуляции, особенностей взаимодействия медиаторов с иммунокомпетентными клетками, механизмов реализации провоспалительных эффектов при ХЭ.

Цель исследования - расширить представления о патогенезе привычного выкидыша.

Материал и методы

Проспективное обсервационное сравнительное исследование выполнено на базе ГБУЗ ГКБ № 31 им. акад. Г.М. Савельевой ДЗМ. Основную группу составили 53 пациентки репродуктивного возраста с привычным невынашиванием беременности (ПНБ) в анамнезе и гистологически верифицированным ХЭ. Группу морфологического контроля составили биоптаты эндометрия 10 фертильных женщин, без ХЭ. Выполнен анализ количественных и качественных характеристик популяции ТК эндометрия в зависимости от степени выраженности ХЭ.

Критерии включения: пациентки репродуктивного возраста с привычным выкидышем, наличие ХЭ, верифицированного патоморфологически и иммуногистохимически. Включенные в исследование пациентки подписали добровольное информированное согласие в соответствии с Хельсинской декларацией Всемирной медицинской ассоциации.

Критерии исключения: злокачественные новообразования органов репродуктивной системы, беременность и лактация, тяжелые соматические заболевания, сахарный диабет, первичные и вторичные иммунодефицитные состояния, кесарево сечение и миомэктомия в анамнезе.

Образцы эндометрия получали путем пайпель-биопсии, патоморфологическое исследование проводили в среднюю стадию фазы пролиферации (7-10-й день менструального цикла). Гистологическое исследование биоптатов эндометрия было проведено в соответствии с модифицированными критериями Нойеса.

Фрагменты эндометрия фиксировали в забуференном 4% формальдегиде и заливали в парафин. Парафиновые срезы ткани (толщиной 5 и 2 мкм для гистохимического и иммуногистохимического окрашивания соответственно) депарафинизировали ксилолом и регидратировали в соответствии со стандартным протоколом [13].

Для иммуногистохимического анализа проводили демаскировку антигена при температуре 95 °C (30 мин) в специализированном буфере R-UNIVERSAL (Aptum Biologics Ltd., Southampton, SO16 8AD, Великобритания). Блокирование эндогенных Fc-рецепторов перед инкубацией с первичными антителами (АТ) не проводилось в соответствии с практическими рекомендациями [14]. После блокады активности эндогенной пероксидазы (при необходимости) наносили первичные АТ в концентрации от 1 до 5 мкг/мл и инкубировали в течение ночи при температуре +4 °C. Визуализацию первичных АТ проводили c помощью вторичных АТ, конъюгированных с пероксидазой хрена (amplistain™ anti-mouse 1-step HRP или amplistain™ anti-rabbit 1-step HRP, SDT GmbH, Германия), и системы детекции DAB Peroxidase Substrat Kit (#SK-4100, Vector Laboratories, Burlingame, CA, США). При реализации дизайна иммуногистохимического окрашивания с одновременной детекцией нескольких молекулярных мишеней использовали вторичные АТ, конъюгированные с флуорохромами Alexa Fluor-488 (goat anti-rabbit IgG Ab, #ab150077) или Cy3 (goat anti-mouse IgG Ab, #ab97035), с итоговой концентрацией АТ от 5 до 10 мкг/мл PBS. Ядра контрастировали с помощью гематоксилина Майера (HK-G0-DL01, "Биовитрум") с последующим заключением срезов в постоянную монтажную среду или раствором DAPI (#D9542-5MG, Sigma) при использовании временной монтажной среды [Vectashield^® Mounting Medium (#H-1000), Vector Laboratories, Burlingame, CA, США].

Для определения иммунного и стромального ландшафта эндометрия использовали набор различных флуорохромов OPAL с системой мультиплексной визуализации Mantra 2 Quantitative Pathology Imaging System (Akoya Biosciences, США) на базе микроскопа Olympus BX43, оснащенного мульти­спектральной 12-битной монохромной высокочувствительной ПЗС-камерой научного класса с настраиваемым спектральным фильтром на жидких кристаллах.

Гистохимическое окрашивание толуидиновым синим, многокомпонентным раствором Гимзы и пикро Маллори, гематоксилином и эозином, а также импрегнация серебром проводили согласно инструкции производителя [14].

Для идентификации ХЭ использовали следующие морфологические критерии:

1. Слабо выраженный ХЭ (СВХЭ) характеризуется:

• отсутствием фиброза;
• площадью просвета артериол (Sпр, мкм²) в диапазоне 150≤Sпр≤449 мкм²;
• диаметром просвета артериол (Dпр, мкм) в пределах 10,0≤Dпр≤19,9 мкм;
• количеством CD138⁺-клеток не более 1.

2. Умеренно выраженный ХЭ (УВХЭ) определяется при наличии:

• фиброза;
• площади просвета артериол (Sпр, мкм²) в интер­вале 100≤Sпр≤149 мкм²;
• диаметра просвета артериол (Dпр, мкм) от 8,0 до 9,9 мкм;
• числа CD138⁺-клеток, равного 2 или 3.

3. Выраженный ХЭ (ВХЭ) диагностируется при следующих показателях:

• наличии фиброза;
• площади просвета артериол (Sпр, мкм²), не превышающей 99 мкм²;
• диаметре просвета артериол (Dпр, мкм), составляющем не более 7,9 мкм;
• количестве CD138-положительных клеток 4 и более.

Окрашенные срезы исследовали на моторизованном микроскопе ZEISS Axio Imager.Z2, используя для фото­документирования в том числе объективы Zeiss alpha Plan-Apochrom 100×/1,46 Oil DIC M27, Zeiss Plan-Apochrom 150×/1,35 Glyc DIC Corr M27 и цветную камеру ZEISS Axiocam 712. Полученные изображения обрабатывали с помощью программного обеспечения "Zen 3.0 Light Microscopy Software Package", "ZEN Module Bundle Intellesis & Analysis for Light Microscopy", "ZEN Module Z Stack Hardware" (Carl Zeiss Vision, Германия).

Картирование и визуализацию окрашенных срезов проводили после сканирования всего гистологического среза с использованием цифрового патологического сканера слайдов (флуоресцентного) KF-FL-005 (Нинбо, Чжэцзян, Китай), объектива ×40 ScanScope CS (Leica Biosystems, Дир Парк, Иллинойс, США). С целью количественного анализа клеток-мишеней на единицу площади эндометрия и определения абсолютного числа ТК был проведен планиметрический анализ в программном продукте QuPath [15]. Идентификацию ядер осуществляли с применением расширения Stardist [16]. Для сегментации структур или иммунопозитивных клеток-мишеней и их стратификации использовали встроенный в QuPath пиксельный классификатор.

Статистический анализ осуществляли с использованием пакета программ SPSS (версия 13.0, IBM, США). Результаты представлены в виде среднего значения (M) ± m (стандартная ошибка среднего). Для оценки значимости различий между 2 группами использовали t-критерий Стьюдента или U-критерий Манна-Уитни в случае непараметрического распределения. Статистическую значимость считали равной: p<0,05 -по сравнению с группой морфологического контроля, p<0,01 - по сравнению с группой морфологического контроля.

Результаты и обсуждение

В ходе исследования при ХЭ наблюдалась высокая степень солокализации ТК с CD14⁺-клетками эндометрия (рис. 1F), с различными типами клеточного взаимодействия - юкстакринным и паракринным (рис. 1A, G, N). Цитотопографический анализ верифицировал наличие контактов ТК с CD14⁺-клетками на участках цитоплазмы различной площади (рис. 1). Контакт с цитоплазматическими выростами ТК был идентифицирован как на небольшой площади моноцитов (рис. 1Е, F, K, O), так и на более протяженных участках с усилением выраженности эндометрита (рис. 1A’, B, С, M, P, Q, T). Отличием ХЭ было увеличение площади соприкосновения ТК с CD14⁺-клетками за счет отростчатых образований, а также локусов одномоментного контакта с несколькими клетками эндометрия (рис. 1H, I, L, O, Q, S). Выраженная интеграция ТК в локальные скопления CD14⁺-клеток создавала структуру, напоминающую мультиклеточную сеть - функциональный синцитий. Гистотопографические особенности были обусловлены локально ограниченной аккумуляцией, варьирующей в зависимости от степени выраженности ХЭ.

Исследование взаимной солокализации ТК и макрофагов М1-типа показало, что в цитоплазме ТК содержится значительное количество макросиалина (рис. 2Е). Выявлена корреляция экспрессии макросиалина в ТК со степенью выраженности эндометрита. Наибольший пул ТК, иммунопозитивных к CD68⁺, формировался при выраженном ХЭ (рис. 2В). Регистрировали высокую плотность контактирования ТК с М1 при менее выраженном воспалении (рис. 2С). Пространственное фенотипирование показало, что в биоптатах при умеренно выраженном и тяжелом ХЭ наибольшее количество CD68⁺-макрофагов локализовалось в фокусах с накоплением ТК (рис. 2F, I). В локусах скопления макрофагов ТК при СВХЭ встречались в минимальном количестве или отсутствовали. 3D-моделирование продемонстрировало отсутствие обширного таргетного взаимодействия ТК с макрофагами М1-типа (в отличие от моноцитов) на значительных участках цитоплазмы (рис. 2G, L). Юкстакринная локализация ТК характеризовалась небольшим локусом соприкосновения (рис. 2Н, J, K).

Исследование взаимодействия ТК с М2-типа показало максимальный профиль популяции CD163⁺-макрофагов при СВХЭ и снижение их содержания при ВХЭ (рис. 3B). Картирование ТК и М2 типа при каждом типе ХЭ показало варианты клеточной комбинаторики - от активного скопления CD163⁺-макрофагов с ТК до изолированных зон отдельных популяций (рис. 3Е-E’’). Локусы активного взаимодействия клеток (рис. 3G) встречались при ХЭ различной выраженности, с превалированием паракринного воздействия ТК на М2-типа (рис. 3С). Интеграция ТК в сеть макрофагов осуществлялась за счет цитоплазматических выростов, позволяющих контактировать с двумя и более CD163⁺-клетками (рис. 3G, H, I, J, L). При изучении персональной вариабельности данных гистотопографических особенностей на ТК были выявлены цитоплазматические выросты других клеток, иммунопозитивных к CD163⁺ (рис. 3F). Тесную площадь соприкосновения наблюдали при интеграции ТК в сеть М2-типа.

Активация ТК формирует высокую чувствительность к ряду компонентов специфического тканевого микроокружения и перестройку рецепторного аппарата с дальнейшей чрезмерной секрецией биогенных аминов, цитокинов и специфических протеаз с провоспалительной активностью [17, 18]. В нашем исследовании впервые выполнено профилирование функциональной архитектуры взаимодействия ТК с иммунокомпетентными клетками эндометрия и показаны ключевые механизмы участия триптазы в развитии интраорганного воспаления. Сложность коммуникативных взаимо­действий иммунных и клеточных факторов, включая стромальные и эпителиальные клетки, при ХЭ была представлена ранее [19]. Пространственные закономерности секреции триптазы при активации ТК отражают механизм развития хронического воспаления, выраженная активность которого неизбежно приводит к формированию профиброгенных ниш с избыточным образованием внеклеточного матрикса.

Полученные нами результаты подтверждают значимые изменения показателей при различной выраженности ХЭ, отражая взаимодействия ТК с другими субпопуляциями иммунных клеток тканевого микроокружения эндометрия. Эти факты доказывают эпигенетические механизмы развития биологических эффектов триптазы при юкста- и пара­кринном воздействии ТК на моноциты, макрофаги, лимфо­циты и другие клетки эндометрия. Обозначенный нами иммуномодулирующий механизм ТК включает пространственные признаки взаимодействия с другими клеточными популяциями врожденного и приобретенного иммунитета эндометрия, специфические при различной выраженности ХЭ. Аномальное повышение числа ТК при ПНБ также описано в других исследованиях [20].

Заключение

В основе патогенеза ПНБ лежат пространственные законо­мерности интеграции ТК в иммунный ландшафт эндометрия с образованием многокомпонентных морфогенетических кластеров, в зависимости от выраженности ХЭ. Установлены морфологические детерминанты мультикластерной среды, определяемой сложными пространственными клеточными взаимоотношениями эндометрия.

Литература/Referenses

1. Lee S.K., Kim C.J., Kim D.J., Kang J.H. Immune cells in the female reproductive tract. Immune Netw. 2015; 15 (1): 16-26. DOI: https://doi.org/10.4110/in.2015.15.1.16 Epub 2015 Feb 17. PMID: 25713505; PMCID: PMC4338264.

2. Elieh-Ali-Komi D., Shafaghat F., Alipoor S.D., Kazemi T., Atiakshin D., Pyatilova P., et al. Immunomodulatory significance of mast cell exosomes (MC-EXOs) in immune response coordination. Clin Rev Allergy Immunol. 2025; 68 (1): 20. DOI: https://doi.org/10.1007/s12016-025-09033-6 PMID: 39976807; PMCID: PMC11842441.

3. Marshall J.S., Warrington R., Watson W., Kim H.L. An introduction to immunology and immunopathology. Allergy Asthma Clin Immunol. 2018; 14 (suppl 2): 49. DOI: https://doi.org/10.1186/s13223-018-0278-1

4. Norrby K. On connective tissue mast cells as protectors of life, reproduction, and progeny. Int J Mol Sci. 2024; 25: 4499. DOI: https://doi.org/10.3390/ijms25084499

5. Atiakshin D., Morozov S., Dlin V., Kostin A., Volodkin A., Ignatyuk M., et al. Renal mast cell-specific proteases in the pathogenesis of tubulointerstitial fibrosis. J Histochem Cytochem. 2024; 72 (8-9): 495-515. DOI: https://doi.org/10.1369/00221554241274878 PMID: 39263893; PMCID: PMC11529666.

6. Atiakshin D., Patsap O., Kostin A., Mikhalеva L., Buchwalow I., Tiemann M. Mast cell tryptase and carboxypeptidase A3 in the formation of ovarian endometrioid cysts. Int J Mol Sci. 2023; 24 (7): 6498. DOI: https://doi.org/10.3390/ijms24076498 PMID: 37047472; PMCID: PMC10095096.

7. Ribatti D. Tryptase and tumor angiogenesis. Front Oncol. 2024 Dec 19; 14: 1500482. DOI: https://doi.org/10.3389/fonc.2024.1500482 PMID: 39749033; PMCID: PMC11693740.

8. Vitte J. Human mast cell tryptase in biology and medicine. Mol Immunol. 2015; 63 (1): 18-24.

9. Longo V., Tamma R., Brunetti O., Pisconti S., Argentiero A., Silvestris N., et al. Mast cells and angiogenesis in pancreatic ductal adenocarcinoma. Clin Exp Med. 2018; 18 (3): 319-23. DOI: https://doi.org/10.1007/s10238-018-0493-6 Epub 2018 Feb 28. PMID: 29492715.

10. Pejler G., Abrink M., Ringvall M., Wernersson S. Mast cell proteases. Adv Immunol. 2007; 95: 167-255. DOI: https://doi.org/10.1016/S0065-2776(07)95006-3 PMID: 17869614.

11. Melo F.R., Vita F., Berent-Maoz B., Levi-Schaffer F., Zabucchi G., Pejler G. Proteolytic histone modification by mast cell tryptase, a serglycin proteoglycan-dependent secretory granule protease. J Biol Chem. 2014; 289 (11): 7682-90. DOI: https://doi.org/10.1074/jbc.M113.546895 Epub 2014 Jan 29. PMID: 24478313; PMCID: PMC3953279.

12. Melo F.R., Wallerman O., Paivandy A., Calounova G., Gustafson A.M., Sabari B.R., et al. Tryptase-catalyzed core histone truncation: a novel epigenetic regulatory mechanism in mast cells. J Allergy Clin Immunol. 2017; 140 (2): 474-85. DOI: https://doi.org/10.1016/j.jaci.2016.11.044 Epub 2017 Jan 17. PMID: 28108335.

13. Melo F.R., Santosh Martin S., Sommerhoff C.P., Pejler G. Exosome-mediated uptake of mast cell tryptase into the nucleus of melanoma cells: a novel axis for regulating tumor cell proliferation and gene expression. Cell Death Dis. 2019; 10 (9): 659. DOI: https://doi.org/10.1038/s41419-019-1879-4 PMID: 31506436; PMCID: PMC6736983.

14. Alanazi S., Melo F.R., Pejler G. Tryptase regulates the epigenetic modification of core histones in mast cell leukemia cells. Front Immunol. 2021; 12: 804408. DOI: https://doi.org/10.3389/fimmu.2021.804408 PMID: 34925389; PMCID: PMC8674432.

15. Shamarakova M.V., Nizyaeva N.V., Bogdanova I.M., Boltovskaya M.N., Artemyeva K.A., Mikhaleva L.M. Rol’ tuchnykh kletok pri fiziologicheskoi i oslozhnennoi beremennosti [The role of mast cells in physiological and complicated pregnancy]. Arkh Patol. 2023; 85 (3): 75-81. DOI: https://doi.org/10.17116/patol20238503175 PMID: 37272444. (in Russian)

16. Niu W., Zhang Y., Liu H., Liang N., Xu L., Li Y., et al. Single-cell profiling uncovers the roles of endometrial fibrosis and microenvironmental changes in adenomyosis. J Inflamm Res. 2023; 16: 1949-65. DOI: https://doi.org/10.2147/JIR.S402734 PMID: 37179754; PMCID: PMC10167994.

17. Skarzynski D.J., Szóstek-Mioduchowska A.Z., Rebordão M.R., Jalali B.M., Piotrowska-Tomala K.K., Leciejewska N., et al. Neutrophils, monocytes and other immune components in the equine endometrium: friends or foes? Theriogenology. 2020; 150: 150-7. DOI: https://doi.org/10.1016/j.theriogenology.2020.01.018 Epub 2020 Jan 13. PMID: 31973963.

18. Zhang Z., Kurashima Y. Two sides of the coin: mast cells as a key regulator of allergy and acute/chronic inflammation. Cells. 2021; 10 (7): 1615. DOI: https://doi.org/10.3390/cells10071615 PMID: 34203383; PMCID: PMC8308013.

19. Mikhalev S.A., Kurtser M.A., Radzinsky V.E., Beeraka N.M., Kostin A.A., Atiakshin D.A., et al. Immune and extracellular matrix dynamics in chronic endometritis: insights into endometrial homeostasis and fibrogenic niche evolution. Int J Biomed. 2025; 15 (1): 119-28. DOI: https://doi.org/10.21103/Article15(1)_OA11

20. Derbala Y., Elazzamy H., Bilal M., Reed R., Salazar Garcia M.D., Skariah A., et al. Mast cell-induced immunopathology in recurrent pregnancy losses. Am J Reprod Immunol. 2019; 82: e13128. DOI: https://doi.org/10.1111/aji.13128

Материалы данного сайта распространяются на условиях лицензии CC BY-NC-ND 4.0 (Creative Commons Attribution-NonCommercial-NoDerivatives 4.0 International)