Morphohistological and immunohistochemical features of the placenta in preeclampsia risk groups

• Fatima В. Kazanchi
• Margarita D. Andreeva
• Aleksandr A. Verevkin

Abstract

The aim of the study was to assess the histopathological features of the placenta after the end of pregnancy with the development of preeclampsia and compare it with the results in healthy pregnant women.

Material and methods. A prospective study of the placenta tissue was conducted in groups: 1^st (n=44) – high-risk pregnant women for the development of preeclampsia (PE) and 2^nd group (n=44) – comparison group – low-risk pregnant women of developing PE. Morphological and immunohistochemical studies of placental tissue in both groups were conducted. The immunohistochemical studies with antibodies to platelet-endothelial molecules of cell adhesion (PECAM-1, CD31) and endoglin (CD105) were performed. The number of cells was calculated using the ImageJ program. The coefficient of staining area was calculated.

Results. The immunohistochemical study had showed: endothelial placental cells of pregnant women with PE gave a weak positive reaction to PECAM-1, the coefficient of staining area of the platelet-endothelial cell adhesion molecule was 2.30% [1.51; 3.07]. The reaction to endoglin was sharply positive, its expression was 6.61% [6.30; 7.04]. The immunohistochemical analysis of pregnant placenta without PE: the reaction with antibodies to CD31 was positive in most blood vessels of the chorion, endoglin was present only in individual endothelial cells. The expression levels of the vascular adhesion molecule CD31 (PECAM-1) in group 2 were 7.11% [6.84; 7,50] and endoglin – 3.17% [2.98; 3.51]. The coefficient of staining area of the platelet-endothelial cell adhesion molecule in group 2 was 7.11% [6.84; 7,50], statistically significantly exceeded the expression levels in group 1 – 2.30% [1.51; 3.07], which was statistically significantly different between groups (p=0.036). The expression of endoglin in group 1 was 6.61% [6.30; 7.04] and that was statistically significantly higher than in group 2 – 3.17% [2.98; 3,51], p=0.014. The correlation-regression analysis demonstrated strong feedback between the expression of CD31 and CD105 (r=-0.69, p=0.032).

Conclusion. Low values of PECAM-1 in group 1 can be considered as a manifestation of endothelial dysfunction, characteristic of severe vascular damage with fibrinoid necrosis and thrombosis, which corresponds to the morphology of the studied sections. A significant content of endoglin in samples in patients of group 1 can be regarded as a kind of manifestation of endothelium regeneration. Preeclampsia is associated with low expression of platelet-endothelial cell adhesion molecule (p=0.036) and high level of endoglin expression (p=0.014).

Keywords: preeclampsia; placenta; immunohistochemistry

Введение

Известно, что развитие преэклампсии (ПЭ) связано с прогрессирующими мультисистемными расстройствами, которые сопровождаются протеинурией и гипертензией. Плохая перфузия плаценты может привести к гипоксии, недостаточному выбросу цитокинов, что ведет к повреждению эндотелиальных клеток и развитию дисфункции [1-8].

Хотя сегодня наше понимание патофизиологии ПЭ значительно продвинулось, единых взглядов на истинную этиологию не существует, в связи с чем ее продолжают называть "болезнью теорий". Нет единого понимания восприятия основных биологических механизмов на фоне наблюдаемой дисфункции ряда органов при ПЭ [9].

Данные анализа образцов плаценты человека, полученных от здоровых беременных, отличаются при сравнении с образцами пациенток с ПЭ. Сегодня широко развиваются направления, связанные с определением РНК в пределах ткани. Обнаружены различные РНК, которые соответствовали разным морфологическим структурам: были выявлены отличия по данному критерию при сравнении плацент от здоровых беременных с доношенным сроком с плацентами беременных с ПЭ [10, 11]. Изучается материнская мальперфузия, которая характеризуется нарушением роста плаценты и изменением морфологии дистальных отделов ворсин хориона. Плодная мальперфузия, или фетоплацентарная недостаточность, характеризуется затрудненным кровотоком в пуповине при пролонгировании беременности и связана с изменениями в сосудах хориона, что ведет к очаговым и фокальным изменениям [12-14]. Однако вызывает интерес, что является причиной материнской и плодной мальперфузии, которая характеризуется нарушением кровотока и приводит к ишемии.

В связи с вышесказанным для изучения морфологических и иммуногистохимических (ИГХ) изменений на уровне плаценты мы провели изучение плацент пациенток с ПЭ (1-я группа) и плацент здоровых беременных (без ПЭ - 2-я группа).

Цель исследования - оценить гистопатологическое состояние плаценты после завершения беременности при развитии ПЭ и сравнить с результатами у здоровых бере­менных.

Материал и методы

Проведено проспективное исследование ткани плаценты в 2 группах: 1-я группа (n=44) - беременные высокого риска по развитию ПЭ и 2-я группа (n=44) - группа сравнения - беременные низкого риска развития ПЭ. Все беременные наблюдались в условиях женских консультаций перинатальных центров г. Краснодара на базах ГБУЗ "ККБ № 2" Минздрава Краснодарского края и ГБУЗ "ДККБ" Минздрава Краснодарского края.

Критерии включения в исследование: возраст 18-42 года, одноплодная беременность, подписанное информированное согласие.

Критерии невключения: возраст моложе 18 и старше 42 лет, многоплодная беременность; критерий только для группы сравнения - наличие преждевременных родов или мертворождений в анамнезе, индекс массы тела (ИМТ) 35,0 кг/м² и выше, артифициальные и самопроизвольные аборты в анамнезе, тяжелая экстрагенитальная и гинекологическая патология, пациентки с ВИЧ-позитивным статусом, хроническими вирусными гепатитами и/или с сифилисом в анамнезе либо с высоким риском инфицирования, отсутствием желания участвовать в исследовании.

Критерии исключения: самопроизвольный выкидыш на сроках до 20 нед настоящей беременности, развитие значимых клинических событий, не связанных с проводимым исследованием, отсутствие информации о беременной, отзыв информированного согласия, значимое отклонение от протокола исследования.

После рождения ребенка и последа проведено морфологическое и ИГХ-исследование ткани плаценты в обеих группах. Методика гистологического исследования образцов плаценты выполнялась по следующему алгоритму: гистологическая проводка материала путем его фиксации в забуференном формалине, этаноле, абсолютном этаноле/ксилоле, ксилоле при соответствующей временной и температурной экспозиции. Этапы дегидратирования выполняли при помощи автоматического гистопроцессора TP1020 (Leica, ФРГ). Заливку в парафин выполняли при помощи модульной установки EG1150H (Leica, ФРГ). На ротационном микротоме RM2235 (Leica, Германия) были получены парафиновые срезы толщиной 5 мкм с проведением последующей депарафинизации, гидратации, окрашивания гематоксилином и эозином (Histolab, Швеция). Депарафинированные стекла помещали в термостат с температурой 60 °С на 10-20 мин с последующей последовательной экспозицией в ксилоле и этаноле. Затем их ополаскивали в воде и переносили в трис-солевой буфер.

Выполняли ИГХ-исследование с антителами к тромбоцитарно-эндотелиальным молекулам клеточной адгезии (PECAM-1, CD31) и эндоглину (CD105). Подсчет числа клеток проводили при увеличении ×400 с автоматическим вычислением с использованием программы ImageJ. Рассчитывали коэффициент площади окрашивания (КПО), представляющий собой отношение площади, занимаемой иммунореактивным цветным продуктом, к общей площади среза. Морфологический раздел работы выполнен в лаборатории фундаментальных исследований в области регенеративной медицины Кубанского государственного медицинского университета.

Статистическая обработка данных проведена посредством статистического пакета Statistica 13.3 (Tibco, США). Данные охарактеризованы средним арифметическим (М) и среднеквадратическим (стандартным) отклонением (m), медианой (Ме), нижним и верхним квартилями [25; 75%]. Для всех критериев использовали общепринятый уровень статистической значимости р=0,05 [15].

Результаты

Обе группы были сравнимы по возрасту: в 1-й группе возраст составил 31,2±0,82 года, Ме=31 [28,0; 35,75] год, а во 2-й группе - 31,1±0,79 [26,5; 35,0] года, Ме=31 год; р=0,81. Рост в группах также статистически не отличался и составил: в 1-й группе 163±0,89 см, Ме=164,0 [160,0; 166,0] см, во 2-й группе - 161,1±1,0 [159,3; 168,0] см, Ме=164,5 см; р=0,57. По массе тела беременные на момент включения в исследование также не отличались: в 1-й группе масса тела составляла 67,0±1,61 [60,0; 73,8] кг, Ме=66,0 кг, во 2-й группе - 63,0±1,82 [55,0; 71,0] кг, Ме=60,0 кг. Рассчитанный ИМТ в обеих группах показал следующие данные: в 1-й группе - 24,6±0,68 [21,6; 26,1] кг/м², Ме=23,9 кг/м², во 2-й группе - 23,5±0,65 кг/м² [20,8; 25,7], Ме=22,3 кг/м²; р=0,051. Таким образом мы видим, что обе группы являются репрезентативными по росту, массе тела и ИМТ.

Также группы не отличались по количеству перво- и повторнобеременных: в 1-й группе их было 72,7 и 27,3%, во 2-й группе - 75,0 и 25,0% соответственно; р=0,91. Не выявлено различий отношении таких параметров, как менструальная функция, использование контрацептивов, в том числе и гормональных, а также частота гинекологической и экстрагенитальной патологии. Однако необходимо отметить, что эндокринопатии статистически значимо чаще встречались в 1-й группе исследования, р=0,007. Нами не выявлено статистических отличий между группами в частоте употребления алкоголя и сигарет.

По итогам наблюдения, по окончанию беременности в 1-й группе всего зарегистрировано 44 (100%) случая ПЭ, во 2-й группе - 15 (34,1%); р<0,001. При этом умеренная ПЭ в 1-й группе развилась у 37 (84,1%) беременных и во 2-й - у 12 (27,3%), р<0,001. Тяжелая ПЭ была зарегистрирована у 7 (15,9%) и у 3 (6,8%) соответственно; р=0,18. В 1-й группе нормальное завершение беременности без развития ПЭ отсутствовало, во 2-й группе таких беременных было 29 (65,9%); р<0,001.

В соответствии с дизайном исследования, нами были изучены морфологические маркеры ПЭ у пациенток 1-й и 2-й групп исследования. Получены следующие результаты: во 2-й группе при анализе препаратов выявлено полнокровие капилляров хориона, в строме ворсин отсутствовали клетки Хофбауэра, на поверхности обнаружено небольшое количество фибриноида Лангханса (рис. 1).

Анализ гистологических препаратов показал: в отдельных полях визуализированы мелкие тромбы в межворсинчатом пространстве (рис. 2).

Также нами были выявлены в некоторых препаратах крупные и многочисленные диапедезные кровоизлияния (см. рис. 2), что, по всей видимости, можно связать с гемодинамическими нарушениями в процессе развития беременности у матери.

В отличие от описанных препаратов, характеризующих неосложненное течение беременности, в 1-й группе у пациенток с рисками развития ПЭ и реализацией в нее выявлен выраженный фибриноидный некроз ворсин хориона, КПО которого достигал 4,17% [3,10; 5,03]. Строма ворсин характеризовалась наличием немногочисленных клеток Хофбауэра (рис. 3).

При анализе полученных срезов плацент после перенесенной ПЭ обращало на себя внимание выраженное полнокровие сосудов плаценты. При этом межворсинчатое пространство в большинстве изученных полей зрения содержало излившуюся кровь и тромботические массы (рис. 4).

Таким образом, проведенный анализ показал, что если в 1-й группе нормальное строение плаценты было у 4 (9,3%) пациенток, то во 2-й - у 11 (25,0%); р=0,053. Отмечалось венозное полнокровие у 32 (74,4%) в 1-й группе и у 24 (54,5%) - во 2-й; р=0,053. При этом не выявлено статистической разницы между обеими группами в частоте умеренного венозного полнокровия сосудов: в 1-й группе оно было у 15 (34,9%) и во 2-й группе - у 14 (31%); выраженное - соответственно у 17 (39,5%); р=0,762 и у 10 (22,7%) пациенток; р=0,147. Частота зафиксированных мелких диапедезных кровоизлияний также не отличалась между группами: в 1-й группе они были выявлены у 8 (18,6%), во 2-й группе - у 7 (15,9%) пациенток; р=0,74.

Выявлено статистически значимое отличие в частоте геморрагического пропитывания плодной части хориона: в 1-й группе оно было у 20 (45,6%) и во 2-й - у 6 (13,6%); р<0,001. Кроме того, выявлено статистически значимое отличие по удельному весу крупных сливающихся очагов фибриноидного некроза; р=0,024.

Анализ ИГХ-исследования показал, что эндотелиальные клетки плацент беременных с ПЭ давали слабую положительную реакцию на PECAM-1. По результатам компьютерной морфометрии установлено, что КПО тромбоцитарно-эндотелиальной молекулы клеточной адгезии в препаратах составил 2,30% [1,51; 3,07]. Напротив, реакция на эндоглин была резко положительной, а его экспрессия составила 6,61% [6,30; 7,04], что показано на рис. 5.

На сегодняшний день рассматривается роль CD31 в адгезии лейкоцитов, тромбоцитов к сосудистому эндотелию. Важно понимать, что адгезия лейкоцитов к эндотелию, опо­средованная PECAM-1, который является трансмембранным гомофильным белком адгезии и экспрессируется в эндотелиальных клетках, приводит к внутриклеточной передаче сигнала, а в дальнейшем способствует диапедезу [16], что, возможно, ведет к формированию нарушений в плацентарной ткани на фоне ПЭ.

Проведенное сравнение с результатами ИГХ-исследования плацент беременных без ПЭ показало, что реакция с антителами к CD31 была положительной в большинстве кровеносных сосудов хориона, в то время как эндоглин присутствовал лишь в отдельных эндотелиальных клетках (рис. 6).

Уровни экспрессии молекулы сосудистой адгезии CD31 (PECAM-1) во 2-й группе составили 7,11% [6,84; 7,50] и эндоглина - 3,17% [2,98; 3,51].

Проведенная компьютерная морфометрия показала, что КПО тромбоцитарно-эндотелиальной молекулы клеточной адгезии во 2-й группе равнялся 7,11% [6,84; 7,50] и статистически значимо превосходил уровни экспрессии в 1-й группе - 2,30% [1,51; 3,07] (статистически значимые отличия между группами, p=0,036). Экспрессия эндоглина в материале от пациенток 1-й группы составила 6,61% [6,30; 7,04] и была статистически значимо выше (в 2,1 раза) аналогичного показателя во 2-й группе - 3,17% [2,98; 3,51], р=0,014.

Проведенный корреляционно-регрессионный анализ продемонстрировал сильную обратную связь между показателями экспрессии CD31 и CD105 (r=-0,69, p=0,032), из чего делаем вывод, что при повышении КПО эндоглина выраженность экспрессии CD31 будет снижаться (см. таблицу). Расчеты проведены в 1-й группе у 43 пациенток, так как у одной участницы из группы произошли экстремально ранние преждевременные роды на фоне тяжелой ПЭ.

Полученные результаты компьютерной морфометрии и проведенный корреляционно-регрессионный анализ соотносятся с данными научной литературы: даже нелетальное повреждение эндотелиальных клеток приводит к снижению экспрессии на ее поверхности PECAM-1 (CD31). Отсюда можно сделать вывод, что низкие величины PECAM-1 в 1-й группе можно рассматривать как проявление эндотелиальной дисфункции [16]. Низкая экспрессия PECAM-1 (CD31) характерна для тяжелого повреждения сосудов с фибриноидным некрозом и тромбозами, что мы наблюдали при исследовании гистологических срезов.

По-видимому, высокая экспрессия CD105 (эндоглин) в образцах с летальным повреждением эндотелия может быть объяснена с позиции ремоделирования сосудов и опосредованного сигнала от трансформирующего фактора роста бета. Из чего можно сделать вывод, что значительное содержание эндоглина в образцах у пациенток 1-й группы можно расценить как своеобразное проявление регенерации эндотелия.

Заключение

Таким образом, исследование плацентарной ткани в сравниваемых группах показало, что при высокой степени риска ПЭ, реализующейся в ее тяжелую или умеренную форму, отмечается статистически значимо более низкий уровень экспрессии тромбоцитарно-эндотелиальной молекулы клеточной адгезии (р=0,036) и высокий уровень экспрессии эндоглина (р=0,014). Возможно, именно более высокий уровень экспрессии тромбоцитарно-эндотелиальной молекулы клеточной адгезии при более низких показателях CD105 (эндоглина) является маркером более раннего "старения" плаценты, характерного для развития ПЭ. Возможно, именно данный механизм дает представление о степени выраженности компенсаторных реакций, нарушение которых ведет к развитию ПЭ. Из проведенного исследования видно, что наблюдение в динамике за сосудами матки и плаценты с параллельным определением общепринятых маркеров ПЭ позволит заблаговременно выделить нарушения в единой биологической системе "мать-плацента-плод" при квалифицированной пренатальной диагностике. Происходящее сосудистое ремоделирование на фоне развития ПЭ ведет к уменьшению просвета сосудов, что негативно влияет как на мать, так и на плод.

References

1. Boris D.A., Shmakov R.G. Preeclampsia: contemporary concepts of its pathogenesis. Akusherstvo i ginekologiya [Obstetrics and Gynecology]. 2022; (12): 12–7. DOI: https://doi.org/10.18565/aig.2022.213 (in Russian)

2. Tapil’skaya N.I., Mel’nikov K.N., Kuznetsova I.A., Glushakov R.I. Placental insufficiency and fetal growth restriction: etiology, prevention, and treatment. Meditsinskiy alfavit [Medical Alphabet]. 2020; (4): 6–10. DOI: https://doi.org/10.33667/2078-5631-2020-4-6-10 (in Russian)

3. Jinqqi Q., Bingbing W., Xiuying C., Wei W., Xudong Y. Diagnostic biomolecules and combination therapy for pre-eclampsia. Reprod Biol Endocrinol. 2022; 20 (1): 136. DOI: https://doi.org/10.1186/s12958-022-01003-3

4. Hackelöer M., Schmidt L., Verlohren S. New advances in predict3ion and surveillance of preeclampsia: role of machine learning approaches and remote monitoring. Arch Gynecol Obstet. 2023; 308 (6): 1663–77. DOI: https://doi.org/10.1007/s00404-022-06864-y

5. Thadhni R., Cerdeira A.S., Karumanchi S.A. Translation of mechanistic advances in preeclampsia to the clinic: long and winding road. FASEB J. 2024; 38 (3): e23441. DOI: https://doi.org/10.1096/fj.202301808R

6. Rana S., Burke S.D., Karumanchi S.A. Imbalances in circulating angiogenic factors in the pathophysiology of preeclampsia and related disorders. Am J Obstet Gynecol. 2022; 226 (2S): S1019–34. DOI: https://doi.org/10.1016/j.ajog.2020.10.022

7. Torres-Torres J., Espino-Y-Sosa S., Martines-Portilla R., et al. A narrative review on the pathophysiology of preeclampsia. Int J Mol Sci. 2024; 25 (14): 7569. DOI: https://doi.org/10.3390/ijms25147569

8. Andreeva M.D., Balayan I.S., Karakhalis L.Yu. Early prognosis of preeclampsia: the reality of today. Akusherstvo i ginekologiya: novosti, mneniya, obuchenie [Obstetrics and Gynecology: News, Opinions, Training]. 2023; 11 (1): 19–27. DOI: https://doi.org/10.33029/2303-9698-2023-11-1-19-27 (in Russian)

9. Melchiorre K., Giorgione V., Thilaganathan B. The placenta and preeclampsia: villain or victim? Am J Obstet Gynecol. 2022; 226 (2S): S954–62. DOI: https://doi.org/10.1016/j.ajog.2020.10.024 Epub 2021 Mar 24. PMID: 33771361.

10. Bhalla N., Franzén L., Scheynius A., Papadogiannakis N., Hansson S.R., Lager S., et al. Spatial transcriptomics of human placentas reveal distinct RNA patterns associated with morphology and preeclampsia. Placenta. 2023; 139: 213–6. DOI: https://doi.org/10.1016/j.placenta.2023.07.004 Epub 2023 Jul 5. PMID: 37481829.

11. Benton S.J., Leavey K., Grynspan D., Cox B.J., Bainbridge S.A. The clinical heterogeneity of preeclampsia is related to both placental gene expression and placental histopathology. Am J Obstet Gynecol. 2018; 219 (6): 604.e1–25. DOI: https://doi.org/10.1016/j.ajog.2018.09.036 Epub 2018 Sep 29. PMID: 30278173.

12. Aleksandrovich A.S., Pal’tseva A.I., Aleksinsky V.S. Features of placenta morphology in pregnant women with fetoplacental insufficiency. Sovremennye problemy gigieny, radiatsionnoy i ekologicheskoy meditsiny [Modern Problems of Hygiene, Radiation and Environmental Medicine]. 2019; (9): 3–15. (in Russian)

13. Pavlova N.G., Bezhenar’ V.F., Bol’shakova M.V., Pastushenkov V.L., Yakovleva A.A., Karev V.E. Expression of hypoxia-inducible factor (HIF-1α) in the placenta and fetal brain tissue in chronic placental insufficiency under experimental conditions. Problemy reproduktsii [Problems of Reproduction]. 2022; 28 (1): 36–44. DOI: https://doi.org/10.17116/repro20222801136 (in Russian)

14. Wardinger J.E., Ambati S. Placental Insufficiency. StatPearls Publishing, 2021.

15. Khalafyan A.A. STATISTICA. Mathematical statistics with elements of probability theory. Moscow: BINOM, 2010: 410 p. (in Russian)

16. Goncharov N.V., Popova P.I., Avdonin P.P., Kudryavtsev I.V., Serebryakova M.K., Korf E.A., et al. Endothelial markers in health and disease. Biologicheskie membrany [Biological Membranes]. 2020. Vol. 37 (1): 3–21. DOI: https://doi.org/10.31857/S0233475519040054 (in Russian)

All articles in our journal are distributed under the CC BY-NC-ND 4.0 (Creative Commons Attribution-NonCommercial-NoDerivatives 4.0 International)