Features of the ploidy status of embryos cultured using traditional and time-lapse technology (TLT) in women of optimal and older reproductive age

• Ksenia V. Krasnopolskaya
• Anastasia A. Samoilova
• Irina Yu. Ershova
• Kamila M. Isakova
• Aglaya L. Konkova
• Tatiana V. Bocharova

Abstract

The aim of the study was to investigate the influence of traditional and time-lapse technologies (TLT) for culturing embryos on their ploidy status according to PGT-A data, taking into account the age of the women examined.

Material and methods. 581 blastocysts grown in either a traditional CO2 incubator Binder CB 150 (n=338) or in a time-lapse incubator EmbryoScope + ES-P1 (n=243) were studied using PGT-A, NGS. Of the total number of blastocysts tested, 88 were obtained from women under 36 years of age and 493 from women over 36 years of age.

Results. When using traditional and time-lapse cell culture technologies, the frequency of generation of euploid blastocysts did not differ significantly in cohorts of embryos obtained from women under 36 years of age (70.9 vs 78.9%, p=0.412) and over 36 years of age (40.8 vs 46.9%, p=0.425). Among embryos from women over 36 years of age, in comparison with embryos from younger patients, there was a significant decrease (by approximately 20%) in the proportion of euploid blastocysts suitable for transfer when using both traditional cultivation (p=0.004) and TLT (p<0.001).

Conclusion. The use of time-lapse cell culture technology in comparison with traditional methodology does not reduce the frequency of embryonic aneuploidy. It seems justified to give priority to PGT-A for women of older reproductive age, since they have a significant increase in the proportion of aneuploid embryos, regardless of characteristics of cell incubators used.

Keywords: infertility; time-lapse cell culture technology; blastocysts; preimplantation genetic testing for aneuploidy

REFERENCES

1. Gleicher N., Albertini D.F., Barad D.H., Homer H., Modi D., Murtinger M., et al.; International Do Not Harm Group in IVF (IDNHG-IVF). The 2019 PGDIS position statement on transfer of mosaic embryos within a context of new information on PGT-A. Reprod Biol Endocrinol. 2020; 18 (1): 57. DOI: https://doi.org/10.1186/s12958-020-00616-w

2. Webster A., Schuh M. Mechanism of aneuploidy in human eggs. Trends Cell Biol. 2017; 27 (1): 55–68. DOI: https://doi.org/10.1016/j.tcb.2016.09.002

3. McKinlay Gardner R.J., Amor D.J. Gardner and Sutherland’s chromosome abnormalities and genetic counseling. In: Oxford Monographs on Medical Genetics. 5th ed. Oxford University Press, 2018. DOI: https://doi.org/10.1093/med/9780199329007.001.0001

4. Gardner D., Schoolcraft W., Wagley L., Schlenker T., Stevens J., Hesla J. A prospective randomized trial of blastocyst culture and transfer in IVF. Hum Reprod. 1998; 13 (12): 3434–40. DOI: https://doi.org/10.1093/humrep/13.12.3434

5. Hollands P. The Fertility Promise: the Facts Behind in vitro Fertilisation (IVF). Bentham Science Publishers, 2021. DOI: https://doi.org/10.2174/9789815040289121010013

6. Aparicio-Ruiz B., Romany L., Meseguer M. Selection of preimplantation embryos using time-lapse microscopy in in vitro fertilization: state of the technology and future directions. Birth Defects Res. 2018; 110 (8): 648–53. DOI: https://doi.org/10.1002/bdr2.1226

7. ESHRE Working Group on Time-Lapse Technology; Apter S., Ebner T., Freour T., Guns Y., Kovacic B., Le Clef N., et al. Good practice recommendations for the use of time-lapse technology. Hum Reprod Open. 2020; 2020 (2): hoaa008 DOI: https://doi.org/10.1093/hropen/hoaa008

8. Yang Q., Zhu L., Wang M., Huang B., Li Z., Hu J., et al. Analysis of maturation dynamics and developmental competence of in vitro matured oocytes under time-lapse monitoring. Reprod Biol Endocrinol. 2021; 19: 183. DOI: https://doi.org/10.1186/s12958-021-00868-0

9. Jin L., Dong X., Tan W., Huang B. Incidence, dynamics and recurrences of reverse cleavage in aneuploid, mosaic and euploid blastocysts, and its relationship with embryo quality. J Ovarian Res. 2022; 15 (1): 91. DOI: https://doi.org/10.1186/s13048-022-01026-9

10. Athayde Wirka K., Chen A.A., Conaghan J., Ivani K., Gvakharia M., Behr B., et al. Atypical embryo phenotypes identified by time-lapse microscopy: high prevalence and association with embryo development. Fertil Steril. 2014; 101 (6): 1637–48.e1–5. DOI: https://doi.org/10.1016/j.fertnstert.2014.02.050

11. Soukhov E., Karavani G., Szaingurten-Solodkin I., Alfayumi-Zeadna S., Elharar G., Richter D., et al. Prediction of embryo implantation rate using a sole parameter of timing of starting blastulation. Zigote. 2022; 30 (4): 501–8. DOI: https://doi.org/10.1017/S0967199421000952

12. Ahlström A., Lundin K., Lind A.-K., Gunnarsson K., Westlander G., Park H., et al. A double-blind randomized controlled trial investigating a time-lapse algorithm for selecting Day 5 blastocysts for transfer. Hum Reprod. 2022; 37 (4): 708–17. DOI: https://doi.org/10.1093/humrep/deac020

13. Reignier A., Lefebvre T., Loubersac S., Lammers J., Barriere P., Freour T. Time-lapse technology improves total cumulative live birth rate and shortens time to live birth as compared to conventional incubation system in couples undergoing ICSI. J Assist Reprod Genet. 2021; 38 (4): 917–23. DOI: https://doi.org/10.1007/s10815-021-02099-z

14. Storr A., Venetis C.A., Cooke S., Susetio D., Kilani S., Ledger W. Morphokinetic parameters using time-lapse technology and day 5 embryo quality: a prospective cohort study. J Assist Reprod Genet. 2015; 32 (7): 1151–60. DOI: https://doi.org/10.1007/s10815-015-0534-y

15. Racowsky C., Kovacs P., Martins W.P. A critical appraisal of time-lapse imaging for embryo selection: where are we and where do we need to go? J Assist Reprod Genet. 2015; 32 (7): 1025–30. DOI: https://doi.org/10.1007/s10815-015-0510-6

16. Boueilh T., Reignier A., Barriere P., Freour T. Time-lapse imaging systems in IVF laboratories: a French national survey. J Assist Reprod Genet. 2018; 35 (12): 2181–6. DOI: https://doi.org/10.1007/s10815-018-1302-6

17. Ciray H.N., Campbell A., Agerholm I.E., Aguilar J., Chamayou S., Esbert M., et al.; Time-Lapse User Group. Proposed guidelines on the nomenclature and annotation of dynamic human embryo monitoring by a time-lapse user group. Hum Reprod. 2014; 29 (12): 2650–60. DOI: https://doi.org/10.1093/humper/deu278

18. Rubio I., Galan A., Larreategui Z., Ayerdi F., Bellver J., Herrero J., et al. Clinical validation of embryo culture and selection by morphokinetic analysis: a randomized, controlled trial of the EmbryoScope. Fertil Steril. 2014; 102 (5): 1287–94.e5. DOI: https://doi.org/10.1016/j.fertnstert.2014.07.738

19. Lundin K., Ahlstrome A. Quality control and standardization of embryo morphology scoring and viability markers. Reprod Biomed Online. 2015; 31 (4): 459–71. DOI: https://doi.org/10.1016/j.rbmo.2015.06.026

20. Adamyan L.V., Pivazyan L.G., Krylova E.I., Obosyan L.B., Sarkisova A.I., Nikiforova P.O. The use of time-lapse technology in the process of cultivation, evaluation and selection of embryos during IVF and ICSI procedures: a systematic review. Problemy reproduktsii [Problems of Reproduction]. 2023; 29 (2): 14–22. DOI: https://doi.org/10.17116/repro29232902114 (in Russian)

21. Meseguer M., Hilligsoe K.M., Pedersen K.S., Herrero J., Tejera A., Garrido N. Pregnancy rates after incubation in new time-lapse incubator (embryoscope) providing detailed information about embryo development compared to incubation in a standard incubator. Fertil Steril. 2010; 94 (4): S150. DOI: https://doi.org/10.1016/j.fertnstert.2010.07.603

22. Cruz M., Gadea B., Garrido N., Pedersen K.S., Martínez M., Pérez-Cano I.,et al. Embryo quality, blastocyst and ongoing pregnancy rates in oocyte donation patients whose embryos were monitored by time-lapse imaging. J Assist Reprod Genet. 2011; 28 (7): 569–73. DOI: https://doi.org/10.1007/s10815-011-9549-1

Обсуждение

По современным представлениям, терапевтический успех ЭКО во многом зависит от так называемого эмбрионального фактора, определяемого качеством подготавливаемых к переносу эмбрионов [5]. При использовании традиционных СО₂-инкубаторов о кондиции культивируемых эмбрионов судят по морфологические критериям, которые определяются дискретно, т.е. в отдельные моменты времени на протяжении заданного периода инкубирования. Такие критерии в разные периоды эмбриогенеза включают в себя морфологию пронуклеусов и ядрышек, количество, размер и форму образующихся бластомеров, фрагментацию, мультинуклеацию, экспандирование бластоцисты, внутреннюю клеточную массу и внешний вид трофэктодермы. По завершению этапа культивирования эмбрионов до стадии бластоцисты предусматривается окончательная оценка морфологических характеристик, по совокупности которых на основе критериев Д. Гарднера [4] делается заключение о пригодности исследуемой бластоцисты к переносу/криоконсервации. Применяемые гарднеровские критерии предусматривают учет степени развития бластоцисты, статус хетчинга (данные характеристики отображаются цифрами от 1 до 6), а также оценку внутренней клеточной массы и трофэктодермы (представляемую буквами А, В, С для каждого из указанных параметров). При нормальном развитии эмбрионов на 5-6-й день культивирования около половины эмбрионов достигает стадии бластоцисты. При этом пригодными для переноса/криоконсервации считаются бластоцисты с оценкой на уровне 2ВВ-6АА.

Внедрение в клиническую практику time-lapse-технологии (TLT) предоставило возможность добавить к традиционным дискретным критериям оценки качества эмбрионов большой массив морфокинетических показателей [6-8]. Такие показатели определяются при круглосуточном наблюдении за эмбрионами в режиме реального времени. Непрерывное наблюдение позволяет получать информацию, которая может быть упущена при традиционной дискретной оценке, в частности аномальные клеточные деления, такие как прямое и обратное дробление бластомеров [9], беспорядочное движение пронуклеусов и замедленное исчезновение ядерных оболочек [10], отклонения в сроках начала кавитации [11]. Полагают, что неполучение такого рода информации при дискретном отслеживании параметров эмбрионального развития в традиционных инкубаторах может приводить к просчетам в ранжировании эмбрионов по качеству, что аргументирует приоритетность использования для той же цели time-lapse-технологии [12-14]. При этом очевидным преимуществом TLT-инкубаторов перед традиционными аналогами является их большее удобство в применении, поскольку эмбриологам не приходится выполнять манипуляции, связанные с дежурным извлечением и оценкой качества развивающихся эмбрионов [15, 16].

Заслуживает внимания, что получаемые в разных плоскостях с помощью цифровой камеры изображения развивающихся эмбрионов собираются через равные короткие промежутки времени и трансформируются в видеоотчет, который обеспечивает возможность документировать происходящие события. Это позволяет проводить углубленный анализ таких видеоотчетов в любое время с привлечением при необходимости дополнительных экспертов, что служит повышению качества эмбриологической диагностики в результате коллегиальных заключений. Архивирование собранной видеоинформации также предоставляет возможность для обучения (повышения квалификации) специалистов-эмбриологов и стандартизации морфокинетических оценок на основе обмена базами данных между эмбриологическими лабораториями [17, 18]. Тем не менее следует признать, что при непрерывной видеорегистрации эмбриогенеза интерпретация патологической значимости обнаруживаемых изменений часто остается непростой задачей, поскольку нет единых (подтверждаемых всеми специалистами) морфокинетических маркеров дефектов качества эмбрионов [19, 20]. Очевидно, что сложившаяся ситуация диктует целесообразность продолжения проведения исследований, направленных на идентификацию критически важных для оценки эмбриогенеза морфокинетических критериев и создание на их основе более надежных прогностических моделей.

Анализируя достоинства time-lapse-технологии клеточного культивирования, отдельные специалисты акцентируют внимание на том, что исключение стресса для развивающихся эмбрионов, связанного с их извлечением из рабочей камеры инкубатора, может служить улучшению условий для эмбриогенеза [21, 22]. Полагают, что это достигается за счет предупреждения изменений в характере внешних воздействий на метаболизм делящихся клеток и в конечном итоге способствует улучшению морфологических характеристик культивируемых эмбрионов. Однако до выполнения данного исследования представлялось неясным, может ли TLT клеточного культивирования за счет того же эффекта (т.е. путем предупреждения метаболического стресса, связанного с извлечением эмбрионов из рабочей камеры инкубатора) обеспечивать уменьшение частоты анеуплоидии среди отбираемых для переноса бластоцист.

Полученные при применении ПГТ-А собственные результаты позволили установить, что поздний репродуктивный возраст (старше 36 лет) ассоциируется с заметным уменьшением доли пригодных для переноса бластоцист из-за выбраковки анеуплоидных эмбрионов, доля которых возрастала почти двукратно. Данная закономерность проявляла себя в одинаковой степени при использовании как традиционной, так и TLT клеточного культивирования. Проведенное одновременно сопоставление результатов в одних и тех же возрастных группах (у женщин в возрасте до и старше 36 лет) не подтвердило статистически значимого различия между когортами, в которых использовали традиционную и TLT клеточного культивирования по критерию частоты получения пригодных для переноса эуплоидных эмбрионов.

Собранный фактический материал позволяет сформулировать два положения.

Во-первых, TLT клеточного культивирования явно не обеспечивает противодействия возрастному фактору, который у женщин старше 36 лет обусловливает резкое возрастание частоты анеуплоидных эмбрионов, и соответственно сокращает долю пригодных для переноса/криоконсервации бластоцист. Данная закономерность весьма наглядно подтверждается фактом одинакового снижения доли эуплоидных эмбрионов у женщин старшего репродуктивного возраста в сравнении с более молодыми пациентками при использовании как традиционной, так и TLT клеточного культивирования.

Во-вторых, в одних и тех же возрастных группах применение TLT вместо традиционного способа выращивания эмбрионов не сопровождается сколько-нибудь заметным выигрышем по критерию увеличения частоты получаемых эуплоидных эмбрионов. Данное наблюдение указывает на то, что частота эмбриональной анеуплоидии в любой возрастной группе вообще не зависит от наличия или отсутствия метаболического стресса, связанного с извлечением культивируемых эмбрионов из рабочей камеры инкубатора. Это означает, что особенности культивирования эмбрионов, определяемые типами клеточных инкубаторов (с использованием или без использования TLT) никак не отражаются на плоидном статусе выращиваемых эмбрионов.

Полученные результаты позволяют утверждать, что ПГТ-А полезно выполнять независимо от технических особенностей применяемых инкубаторов, т.е. оснащенных или нет бесконтактной системой непрерывной видеорегистрации эмбриогенеза. Данная рекомендация является особенно актуальной для женщин позднего репродуктивного возраста, у которых отмечается существенное возрастание доли анеуплоидных эмбрионов при любом из способов их культивирования, сравниваемых в настоящей работе.

Заключение

Выполненное нами исследование приводит к заключению, что целесообразность назначения ПГТ-А не должна определяться техническими особенностями применяемых инкубаторов, поскольку при использовании традиционной и TLT клеточного культивирования частота анеуплоидных эмбрионов оказывается фактически одинаковой. С учетом того что у женщин старшего репродуктивного возраста отмечается драматическое сокращение количества пригодных к переносу эмбрионов из-за прогрессирования частоты эмбриональной анеуплоидии, представляется оправданным приоритетное назначение ПГТ-А именно этому контингенту больных бесплодием, причем независимо от типа использованного клеточного инкубатора.

ЛИТЕРАТУРА

1. Gleicher N., Albertini D.F., Barad D.H., Homer H., Modi D., Murtinger M. et al.; International Do Not Harm Group in IVF (IDNHG-IVF). The 2019 PGDIS position statement on transfer of mosaic embryos within a context of new information on PGT-A // Reprod. Biol. Endocrinol. 2020. Vol. 18, N 1. P. 57. DOI: https://doi.org/10.1186/s12958-020-00616-w

2. Webster A., Schuh M. Mechanism of aneuploidy in human eggs // Trends Cell Biol. 2017. Vol. 27, N 1. P. 55-68. DOI: https://doi.org/10.1016/j.tcb.2016.09.002

3. McKinlay Gardner R.J., Amor D.J. Gardner and Sutherland’s chromosome abnormalities and genetic counseling // Oxford Monographs on Medical Genetics. 5th ed. Oxford University Press, 2018. DOI: https://doi.org/10.1093/med/9780199329007.001.0001

4. Gardner D., Schoolcraft W., Wagley L., Schlenker T., Stevens J., Hesla J. A prospective randomized trial of blastocyst culture and transfer in IVF // Hum. Reprod. 1998. Vol. 13, N 12. P. 3434-3440. DOI: https://doi.org/10.1093/humrep/13.12.3434

5. Hollands P. The Fertility Promise: the Facts Behind in vitro Fertilisation (IVF). Bentham Science Publishers, 2021. DOI: https://doi.org/10.2174/9789815040289121010013

6. Aparicio-Ruiz B., Romany L., Meseguer M. Selection of preimplantation embryos using time-lapse microscopy in in vitro fertilization: state of the technology and future directions // Birth Defects Res. 2018. Vol. 110, N 8. P. 648-653. DOI: https://doi.org/10.1002/bdr2.1226

7. ESHRE Working Group on Time-Lapse Technology; Apter S., Ebner T., Freour T., Guns Y., Kovacic B., Le Clef N. et al. Good practice recommendations for the use of time-lapse technology // Hum. Reprod. Open. 2020. Vol. 2020, N 2. Article ID hoaa008 DOI: https://doi.org/10.1093/hropen/hoaa008

8. Yang Q., Zhu L., Wang M., Huang B., Li Z., Hu J. et al. Analysis of maturation dynamics and developmental competence of in vitro matured oocytes under time-lapse monitoring // Reprod. Biol. Endocrinol. 2021. Vol. 19. P. 183. DOI: https://doi.org/10.1186/s12958-021-00868-0

9. Jin L., Dong X., Tan W., Huang B. Incidence, dynamics and recurrences of reverse cleavage in aneuploid, mosaic and euploid blastocysts, and its relationship with embryo quality // J. Ovarian Res. 2022. Vol. 15, N 1. P. 91. DOI: https://doi.org/10.1186/s13048-022-01026-9

10. Athayde Wirka K., Chen A.A., Conaghan J., Ivani K., Gvakharia M., Behr B. et al. Atypical embryo phenotypes identified by time-lapse microscopy: high prevalence and association with embryo development // Fertil. Steril. 2014. Vol. 101, N 6. P. 1637-1648.e1-e5. DOI: https://doi.org/10.1016/j.fertnstert.2014.02.050

11. Soukhov E., Karavani G., Szaingurten-Solodkin I., Alfayumi-Zeadna S., Elharar G., Richter D. et al. Prediction of embryo implantation rate using a sole parameter of timing of starting blastulation // Zigote. 2022. Vol. 30, N 4. P. 501-508. DOI: https://doi.org/10.1017/S0967199421000952

12. Ahlström A., Lundin K., Lind A.-K., Gunnarsson K., Westlander G., Park H. et al. A double-blind randomized controlled trial investigating a time-lapse algorithm for selecting Day 5 blastocysts for transfer // Hum. Reprod. 2022. Vol. 37, N 4. P. 708-717. DOI: https://doi.org/10.1093/humrep/deac020

13. Reignier A., Lefebvre T., Loubersac S., Lammers J., Barriere P., Freour T. Time-lapse technology improves total cumulative live birth rate and shortens time to live birth as compared to conventional incubation system in couples undergoing ICSI // J. Assist. Reprod. Genet. 2021. Vol. 38, N 4. P. 917-923. DOI: https://doi.org/10.1007/s10815-021-02099-z

14. Storr A., Venetis C.A., Cooke S., Susetio D., Kilani S., Ledger W. Morphokinetic parameters using time-lapse technology and day 5 embryo quality: a prospective cohort study // J. Assist. Reprod. Genet. 2015. Vol. 32, N 7. P. 1151-1160. DOI: https://doi.org/10.1007/s10815-015-0534-y

15. Racowsky C., Kovacs P., Martins W.P. A critical appraisal of time-lapse imaging for embryo selection: where are we and where do we need to go? // J. Assist. Reprod. Genet. 2015. Vol. 32, N 7. P. 1025-1030. DOI: https://doi.org/10.1007/s10815-015-0510-6

16. Boueilh T., Reignier A., Barriere P., Freour T. Time-lapse imaging systems in IVF laboratories: a French national survey // J. Assist. Reprod. Genet. 2018. Vol. 35, N 12. P. 2181-2186. DOI: https://doi.org/10.1007/s10815-018-1302-6

17. Ciray H.N., Campbell A., Agerholm I.E., Aguilar J., Chamayou S., Esbert M. et al.; Time-Lapse User Group. Proposed guidelines on the nomenclature and annotation of dynamic human embryo monitoring by a time-lapse user group // Hum. Reprod. 2014. Vol. 29, N 12. P. 2650-2660. DOI: https://doi.org/10.1093/humper/deu278

18. Rubio I., Galan A., Larreategui Z., Ayerdi F., Bellver J., Herrero J. et al. Clinical validation of embryo culture and selection by morphokinetic analysis: a randomized, controlled trial of the EmbryoScope // Fertil. Steril. 2014. Vol. 102, N 5. P. 1287-1294.e5. DOI: https://doi.org/10.1016/j.fertnstert.2014.07.738

19. Lundin K., Ahlstrome A. Quality control and standardization of embryo morphology scoring and viability markers // Reprod. Biomed. Online. 2015. Vol. 31, N 4. P. 459-471. DOI: https://doi.org/10.1016/j.rbmo.2015.06.026

20. Адамян Л.В., Пивазян Л.Г., Крылова Е.И., Обосян Л.Б., Саркисова А.И., Никифорова П.О. Применение технологии time-lapse в процессе культивирования. Оценки и отбора эмбрионов при проведении процедур экстракорпорального оплодотворения и интрацитоплазматической инъекции сперматозоида: систематический обзор // Проблемы репродукции. 2023. Т. 29, № 2. С. 14-22. DOI: https://doi.org/10.17116/repro29232902114

21. Meseguer M., Hilligsoe K.M., Pedersen K.S., Herrero J., Tejera A., Garrido N. Pregnancy rates after incubation in new time-lapse incubator (embryoscope) providing detailed information about embryo development compared to incubation in a standard incubator // Fertil. Steril. 2010. Vol. 94, N 4. P. S150. DOI: https://doi.org/10.1016/j.fertnstert.2010.07.603

22. Cruz M., Gadea B., Garrido N., Pedersen K.S., Martínez M., Pérez-Cano I. et al. Embryo quality, blastocyst and ongoing pregnancy rates in oocyte donation patients whose embryos were monitored by time-lapse imaging // J. Assist. Reprod. Genet. 2011. Vol. 28, N 7. P. 569-573. DOI: https://doi.org/10.1007/s10815-011-9549-1

All articles in our journal are distributed under the CC BY-NC-ND 4.0 (Creative Commons Attribution-NonCommercial-NoDerivatives 4.0 International)