Анализ развития эмбрионов в процессе их культивирования показал, что у женщин старшего возраста остановка развития эмбрионов на стадии бластомеров (2-3-й день культивирования) была зарегистрирована в 35/44=84,1% случаев, у остальных были получены бластоцисты плохого качества (9/44=15,9%). У молодых женщин остановка развития эмбрионов на 2-3-и сутки культивирования произошла в 9/21=42,9% случаев, у остальных пациенток эмбрионы развились до 4-6-х суток, но бластоцисты хорошего качества получены не были (57,1%). Таким образом, возраст женщины обусловил остановку развития эмбрионов преимущественно на ранних стадиях, что, по всей видимости, связано с дефектами ядерной ДНК эмбрионов у женщин старшего возраста [12].
Обобщая результаты, полученные в ходе исследования, были выявлены клинико-лабораторные факторы, ассоциированные с нарушением развития эмбрионов на 2-3-и и 4-6-е сутки развития. На рис. 1 представлены характеристики, сопряженные с нарушением развития эмбрионов на стадии 2-3-го дня культивирования: поздний репродуктивный возраст; наружный генитальный эндометриоз; бесплодие неясного генеза; ПХТ; гемоконтактные инфекции и их лечение.
)
На рис. 2 представлены факторы, сопряженные с нарушением развития эмбрионов на 4-6-е сутки культивирования: ожирение; аутоиммунные заболевания; аллергические реакции; часто рецидивирующие бактериально-вирусные инфекции; ХВЗ ОМТ; выраженная патозооспермия у партнеров.
Обсуждение
Эмбриологический этап программ ЭКО в конечном итоге обеспечивает успех лечения, который зависит от числа и качества полученных эмбрионов. Естественно, получение достаточного количества зрелых ооцитов, их оплодотворение и развитие эмбриона определяется состоянием репродуктивной системы и общего здоровья пациентов. В то же время ранние стадии развития эмбриона - процесс многофакторный и неизученный.
Считается, что именно качество ооцита определяет успешность первых дней развития эмбриона [13]. Сразу после оплодотворения геном зиготы транскрипционно неактивен и первые стадии дробления зависят исключительно от материнских генов, а точнее от кодируемых ими цитоплазматических факторов, накопленных в период созревания ооцита.
В этой связи логично предположить, что определенные материнские факторы обеспечивают "поломку" ооцита и нарушение развития эмбриона на ранних этапах. В настоящем исследовании показано, что нарушение развития эмбриона на 2-3-и сутки культивирования происходит в 2 раза чаще у женщин позднего репродуктивного возраста по сравнению с молодыми пациентками. Этот факт вполне объясним и подтвержден многими исследованиями, свидетельствующими об увеличении количества анеуплоидных эмбрионов у женщин старшего возраста [14-16].
Результаты работы показали, что ранняя остановка развития эмбрионов сопряжена с генетическими причинами. Так, ломкость Х-хромосомы и особенности кариотипа были выявлены у 3 женщин с ранней остановкой развития эмбрионов и лишь у 1 пациентки, у которой эмбрионы продолжали дробиться после 2-3-го дня культивирования.
Также известно, что ПХТ онкологических заболеваний и лечение гемоконтактных инфекций (ВИЧ, гепатит С) являются гонадотоксичными факторами, повреждающими ДНК ооцита [17-19]. Настоящее исследование подтвердило этот факт (у 5 пациенток с остановкой развития эмбрионов на 2-3-и сутки культивирования проведено химиотерапевтическое лечение онкологического заболевания, а 6 женщин получали лечение по поводу ВИЧ и гепатита С).
Факторы, обусловливающие дефекты созревания ооцитов, обсуждаются в литературе. Полученные в настоящей работе данные подтверждают наличие клинических факторов, которые потенциально могут определять раннюю остановку развития эмбрионов. В то же время в проведенной работе установлено, что ранняя остановка развития эмбрионов наблюдалась у женщин с наружным генитальным эндометриозом в 16,7% случаев, а нарушение развития эмбрионов на поздних стадиях - в 3,1% случаев. Та же закономерность наблюдалась при бесплодии неясного генеза: ранний "арест" у 23,3% пациенток, а у женщин с нарушением развития эмбрионов на поздних стадиях - в 7,7% случаев.
Точные причины возможных дефектов созревания ооцитов при этих патологиях не установлены, хотя в литературе есть работы, указывающие на возможные генетические факторы, обусловливающие нарушение развития ооцитов при бесплодии неясного генеза [20]. Также есть исследования, оценивающие влияние наружного генитального эндометриоза на качество ооцита [21].
Проведенное исследование определило клинические и генетические факторы у пациенток с остановкой развития эмбрионов на 2-3-й дни культивирования, что позволило высказать предположение о повреждении ДНК ооцита у данного контингента женщин. В то же время факторы, влияющие на остановку развития эмбрионов на более поздних стадиях развития (4-6-й день культивирования) можно отнести к эпигенетическим.
В их числе - избыточная масса тела, аутоиммунные заболевания, часто рецидивирующие инфекции, ХВЗ ОМТ. Частота встречаемости этих факторов при поздней остановке развития эмбрионов превышала таковую у женщин с ранним "арестом" эмбриогенеза: избыточная масса тела - 20,0 и 43,1%, аутоиммунные заболевания - 10,0 и 30,8%, хронические воспалительные заболевания - 6,7 и 27,7% соответственно.
Можно предположить следующее: если воздействия на поврежденную ДНК ооцита крайне затруднительны, то коррекция эпигенетических факторов может привести к лучшим исходам программ ЭКО. Отдельного внимания заслуживает остановка развития эмбрионов на 4-6-е дни культивирования при тяжелых формах патозооспермии. Известно, что после 2-3-х суток культивирования включаются собственные эмбриональные гены, однако роль ДНК сперматозоида в этом процессе до конца не ясна.
В настоящем исследовании из 95 пар у 21 супруга диагностирована тяжелая форма патозооспермии, из них у 6 - азооспермия, сперматозоиды были получены при биопсии яичка. Оплодотворение проводили методом ИКСИ, частота оплодотворения составила 68,9%.
Анализ дробления 247 эмбрионов показал, что на стадии дробления (2-3-й день культивирования) остановка развития эмбрионов произошла в 33,4% случаев, в остальных 66,6% случаев эмбрионы развились до стадии морулы и бластоцисты, но ни одна из полученных бластоцист не была пригодна для переноса и криоконсервации. По всей видимости, при тяжелых формах патозооспермии нарушение развития эмбрионов происходит на более поздних стадиях культивирования, когда активируется геном эмбриона, при этом нельзя игнорировать роль ДНК сперматозоида.
Выводы
1. Факторами, ассоциированными с остановкой развития эмбрионов на 2-3-й дни культивирования, являются поздний возраст пациентки (старше 38 лет), гонадотоксичное лечение в анамнезе, наличие ломкой Х-хромосомы и другие особенности кариотипа, что позволят предположить наличие дефекта ДНК ооцита у рассматриваемого контингента пациенток.
2. Ранняя остановка развития эмбрионов при наружном генитальном эндометриозе и бесплодии неясного генеза требует дальнейших исследований, оценивающих влияние этих патологий на формирование дефектов созревания ооцитов.
3. Эпигенетические факторы, к которым можно отнести избыточную массу тела, аутоиммунные заболевания, аллергические реакции и хронические воспалительные заболевания, могут обусловливать нарушение развития эмбрионов на поздних стадиях культивирования и неполучение бластоцист хорошего качества.
4. Нарушение развития эмбрионов после активации собственного генома эмбриона и получение бластоцист плохого качества при тяжелых формах патозооспермии обусловливает необходимость изучения вклада ДНК сперматозоида в процессы раннего эмбриогенеза.
ЛИТЕРАТУРА
1. Orvieto R., Jonish-Grossman A., Maydan S.A., Noach-Hirsh M., Dratviman-Storobinsky O., Aizer A. Cleavage-stage human embryo arrest, is it embryo genetic composition or others? // Reprod. Biol. Endocrinol. 2022. Vol. 20, N 1. P. 52. DOI: https://doi.org/10.1186/s12958-022-00925-2
2. Yanez L.Z., Han J., Behr B.B., Pera R.A.R., Camarillo D.B. Human oocyte developmental potential is predicted by mechanical properties within hours after fertilization // Nat. Commun. 2016. Vol. 7. Article ID 10809. DOI: https://doi.org/10.1038/ncomms10809
3. Li Q., Zhao L., Zeng Y., Kuang Y., Guan Y., Chen B. et al. Large-scale analysis of de novo mutations identifies risk genes for female infertility characterized by oocyte and early embryo defects // Genome Biol. 2023. Vol. 24, N 1. P. 68. DOI: https://doi.org/10.1186/s13059-023-02894-0
4. Ding C., Lu J., Li J., Hu X., Liu Z., Su H. et al. RNA-methyltransferase Nsun5 controls the maternal-to-zygotic transition by regulating maternal mRNA stability // Clin. Transl. Med. 2022. Vol. 12, N 12. Article ID e1137. DOI: https://doi.org/10.1002/ctm2.1137
5. Sahin G.N., Yildirim R.M., Seli E. Embryonic arrest: causes and implications // Curr. Opin. Obstet. Gynecol. 2023. Vol. 35, N 3. P. 184-192. DOI: https://doi.org/10.1097/GCO.0000000000000871
6. Capalbo A., Buonaiuto S., Figliuzzi M., Damaggio G., Girardi L., Caroselli S. et al. Maternal exome analysis for the diagnosis of oocyte maturation defects and early embryonic developmental arrest // Reprod. Biomed. Online. 2022. Vol. 45, N 3. P. 508-518. DOI: https://doi.org/10.1016/_i.rbmo.2022.05.009
7. Xu Y., Shi Y., Fu J., Yu M., Feng R., Sang Q. et al. Mutations in PADI6 cause female infertility characterized by early embryonic arrest // Am. J. Hum. Genet. 2016. Vol. 99, N 3. P. 744-752. DOI: https://doi.org/10.1016/_i.ajhg.2016.06.024
8. Huang L., Tong X., Wang F., Luo L., Jin R., Fu Y. et al. Novel mutations in PATL2 cause female infertility with oocyte germinal vesicle arrest // Hum. Reprod. 2018. Vol. 33, N 6. P. 1183-1190. DOI: https://doi.org/10.1093/humrep/dey100
9. Mu J., Wang W., Chen B., Wu L., Li B., Mao X. et al. Mutations in NLRP2 and NLRP5 cause female infertility characterised by early embryonic arrest // J. Med. Genet. 2019. Vol. 56, N 7. P. 471-480. DOI: https://doi.org/10.1136/imedgenet-2018-105936
10. Alpha Scientists in Reproductive Medicine and ESHRE Special Interest Group of Embryology. The Istanbul consensus workshop on embryo assessment: proceedings of an expert meeting // Hum. Reprod. 2011. Vol. 26, N 6. P. 1270-1283. DOI: https://doi.org/10.1093/humrep/der037
11. Wdowiak A., Bakalczuk S., Bakalczuk G. The effect of sperm DNA fragmentation on the dynamics of the embryonic development in intracytoplasmatic sperm injection // Reprod. Biol. 2015. Vol. 15, N 2. P. 94-100. DOI: https://doi.org/10.1016/i.repbio.2015.03.003
12. Janny L., Menezo Y.J. Maternal age effect on early human embryonic development and blastocyst formation // Mol. Reprod. Dev. 1996. Vol. 45, N 1. P. 31-37. DOI: https://doi.org/10.1002/(SICI)1098-2795(199609)45:1<31::AID-MRD4>3.0.CO;2-T
13. Keefe D., Kumar M., Kalmbach K. Oocyte competency is the key to embryo potential // Fertil. Steril. 2015. Vol. 103, N 2. P. 317-322. DOI: https://doi.org/10.1016/j.fertnstert.2014.12.115
14. Смирнова А.А., Зыряева Н.А., Аншина М.Б. Возрастные изменения и риск хромосомных аномалий в ооцитах человека (обзор литературы) // Проблемы репродукции. 2019. Т. 25. № 2. С. 16-26. DOI: https://doi.org/10.17116/repro201902116
15. Franasiak J.M., Forman E.J., Hong K.H., Werner M.D., Upham K.M., Treff N.R. et al. The nature of aneuploidy with increasing age of the female partner: a review of 15,169 consecutive trophectoderm biopsies evaluated with comprehensive chromosomal screening // Fertil. Steril. 2014. Vol. 101, N 3. P. 656-663.e1. DOI: https://doi.org/10.1016Zj.fertnstert.2013.11.004
16. Verdyck P., Altarescu G., Santos-Ribeiro S., Vrettou C., Koehler U., Griesin-ger G. et al. Aneuploidy in oocytes from women of advanced maternal age: analysis of the causal meiotic errors and impact on embryo development // Hum. Reprod. 2023. Vol. 38, N 12. P. 2526-2535. DOI: https://doi.org/10.1093/humrep/dead201
17. Vankerkem P., Manigart Y., Delvigne A., Ameye L., Konopnicki D., Shaw-Jackson C. et al. In vitro fertilization when men, women, or both partners are positive for HIV: a case-control study // Arch. Gynecol. Obstet. 2017. Vol. 295, N 6. P. 14931507. DOI: https://doi.org/10.1007/s00404-017-4374-0
18. Nurudeen S.K., Grossman L.C., Bourne L., Guarnaccia M.M., Sauer M.V., Douglas N.C. Reproductive outcomes of HIV seropositive women treated by assisted reproduction // J. Womens Health (Larchmt.). 2013. Vol. 22, N 3. P. 243-249. DOI: https://doi.org/10.1089/jwh.2012.3855
19. Pereira N., Schattman G.L. Fertility preservation and sexual health after cancer therapy // J. Oncol. Pract. 2017. Vol. 13, N 10. P. 643-651. DOI: https://doi.org/10.1200/JOP.2017.023705
20. Homer H.A. The role of oocyte quality in explaining "unexplained" infertility // Semin. Reprod. Med. 2020. Vol. 38, N 1. P. 21-28. DOI: https://doi.org/10.1055/s-0040-172137
21. Sanchez A.M., Vanni V.S., Bartiromo L., Papaleo E., Zilberberg E., Can-diani M. et al. Is the oocyte quality affected by endometriosis? A review of the literature // J. Ovarian Res. 2017. Vol. 10, N 1. P. 43. DOI: https://doi.org/10.1186/s13048-017-0341-4