Отмечалась связь между применением препарата LACTIN-V и концентрацией растворимых иммунных факторов, а также количеством разных таксонов бактерий. Чтобы изучить потенциальные причинно-следственные связи, лежащие в основе этих корреляций, авторы оценили опосредующее влияние основных таксонов бактерий на связь между применением препарата LACTIN-V и концентрациями IL-1α, растворимого E-кадгерина и IP-10 через 24 нед. Наблюдалась прямо пропорциональная зависимость между изменением концентрации IL-1α и численности видов Prevotella (β 0,179, SE 0,039; p<0,0001) и Megasphaera (0,085, 0,026; p=0,0016; табл. 3). Наблюдалась обратно пропорциональная зависимость между концентрацией растворимого E-кадгерина и изменением численности L. crispatus (-0,128, 0,036; p=0,0007) и прямо пропорциональная связь с изменением численности видов Prevotella (0,338, 0,038; p<0,0001) и видов Megasphaera (0,157, 0,029; p<0,0001). Изменение концентрации IP-10 было прямо пропорционально изменению численности L. crispatus (0,108, 0,035; p=0,0029) и обратно пропорционально изменению численности видов Prevotella (-0,161, 0,050, p=0,0022) и Megasphaera (-0,135, 0,029; р<0,0001).
)
Затем авторы оценили, были ли изменения иммунных параметров слизистой половых органов, связанные с применением препарата LACTIN-V, опосредованы вызванными лечением изменениями бактериального состава вагинальной микрофлоры. При использовании изменения концентрации IL-1α в качестве зависимой переменной отмечалась значимая связь с изменением численности видов Prevotella (β 0,167, SE 0,039; p<0,0001; см. табл. 3) и Megasphaera (0,075, 0,026, p=0,0058), но не в случае применения препарата LACTIN-V. При использовании изменения концентрации растворимого E-кадгерина в качестве зависимой переменной отмечалась связь с изменением численности видов L. crispatus (-0,114, 0,038, p=0,0037), Prevotella (0,327, 0,038; p<0,0001) и Megasphaera (0,148, 0,030); p<0,0001), но не в случае применения препарата LACTIN-V. Аналогичным образом изменение IP-10 не было значимо связано с данными группы лечения, но прямо пропорционально изменению численности L. crispatus (0,096, 0,037; p=0,011) и обратно пропорционально изменению численности Prevotella spp. (-0,148, 0,051, p=0,0051) и Megasphaera spp. (-0,128, 0,029; p<0,0001).
Наконец, авторы исследовали, имел ли место дифференцированный иммунный эффект колонизации влагалища после применения бактерий L. crispatus, штамм CTV-05. Из 21 отобранной участницы с высокой численностью L. crispatus через 24 нед у 14 (67%) было выявлено преобладание штамма CTV-05, а у 7 (33%) - бактерий, не относящихся к штамму CTV-05. Хотя преобладание бактерий L. crispatus, штамм CTV-05 или не относящихся к штамму CTV-05, не было статистически значимо связано с соответствующим снижением концентрации IL-1a и растворимого E-кадгерина (p=0,74 для обоих факторов), повышение вагинальных концентраций IP-10 среди участниц с преобладанием штаммов, не относящихся к CTV-05, статистически значимо превышало этот показатель у участниц с преобладанием штамма CTV-05 после лечения препаратом LACTIN-V (p=0,010; см. рис. 2).
)
Обсуждение
Интравагинальное применение нового биотерапевтического препарата LACTIN-V на основе живых бактерий L. crispatus после лечения БВ путем местного применения метронидазола снижает частоту рецидивов. При этом эффекты сохраняются в течение 3 мес после получения последней дозы препарата LACTIN-V [20]. В данном исследовании авторы показали, что лечение препаратом LACTIN-V было связано с соответствующим стойким снижением воспаления слизистой оболочки половых органов и концентрации биомаркера нарушения целостности эпителиального барьера. Повторяя результаты исследования, изучающего влияние стандартной терапии бактериального вагиноза на иммунные факторы [11], вторичный анализ показал увеличение вагинальных концентраций IP-10 (хемоаттрактантный хемокин, связанный с повышенным риском заражения ВИЧ у женщин) после успешного лечения БВ [9, 23]. Это устойчивое влияние на иммунитет слизистой женских половых путей было в первую очередь опосредовано снижением численности таксонов, связанных с бактериальным вагинозом, особенно видов Prevotella и Megasphaera, и в меньшей степени повышением численности L. crispatus. Увеличение концентрации IP-10 в вагинальном секрете было непосредственно связано с численностью бактерий L. crispatus, не относящихся к штамму CTV-05, а не с терапевтическим штаммом CTV-05.
Быстрый рецидив БВ после стандартного лечения антибиотиками вызвал значительный интерес к альтернативным стратегиям лечения и вспомогательным препаратам при лечении антибиотиками [16]. Эти стратегии включают использование пробиотиков на основе бактерий Lactobacillus, не относящихся к виду crispatus, или биотерапевтических препаратов, содержащих живые бактерии либо в виде монотерапии, либо в комбинации со стандартными антибиотиками. Однако было показано, что не все пробиотики снижают частоту рецидивов БВ [24]. Три исследования, в которых оценивали иммунные факторы слизистой оболочки половых органов, продемонстрировали незначительный эффект пробиотиков на основе Lactobacillus, либо его отсутствие [17, 18], либо увеличение концентраций провоспалительных цитокинов после использования пробиотиков [19].
Настоящее исследование является первым, показавшим, что применение биотерапевтического препарата на основе живых бактерий L. crispatus после стандартной местной терапии метронидазолом снижает концентрации провоспалительного цитокина в слизистой оболочке половых органов и маркера разрушения эпителия. Важным различием между настоящим исследованием и более ранними было использование биотерапевтического препарата, полностью состоящего из живых бактерий L. crispatus, вида Lactobacillus, которые, как известно, естественным образом преобладают в составе вагинальной микрофлоры [3] и оказывают полезное влияние на иммунитет слизистой оболочки половых органов и защиту от ВИЧ [7, 14, 25].
Преобладание во влагалище L. crispatus, а не L. iners, отмечавшееся в продольном когортном исследовании [7], было связано со сниженным риском заражения ВИЧ по сравнению с типом микробиоты, соответствующим бактериальному вагинозу. Неясно, зависят ли эффекты защиты от заражения ВИЧ, связанные с L. crispatus, от прямого противовоспалительного действия, устранения бактерий, ассоциированных с бактериальным вагинозом, или других механизмов. Преобладание L. crispatus в вагинальной микрофлоре связано со сниженными вагинальными концентрациями провоспалительных цитокинов, включая IL-1α [14]. Авторы связывают пропорциональное повышение уровня L. crispatus со сниженной концентрацией провоспалительных цитокинов и хемокинов в слизистой половых органов [25].
У женщин с преобладанием L. crispatus в вагинальной микрофлоре также отмечаются более редкие случаи перехода к микробиоте, соответствующей бактериальному вагинозу, чем у женщин с преобладанием L. iners; это позволяет предположить, что L. crispatus может конкурентно вытеснять бактерии, связанные с воспалительным БВ [26], что частично обусловлено продукцией молочной кислоты и антимикробных метаболитов [27]. Модели in vitro показывают, что L. crispatus является основным продуцентом молочной кислоты в женских половых путях [27], и это может непосредственно подавлять выработку провоспалительных цитокинов [28, 29]. Кроме того, добавление супернатанта с L. crispatus или только L. crispatus, или и того, и другого на эпителий снижало выработку провоспалительных цитокинов по сравнению с эффектом бактерий, ассоциированных с бактериальным вагинозом [6, 14], и защищало от разрушения эпителиального барьера в ответ на провоспалительные стимулы [6].
Снижение воспаления в области половых органов после применения LACTIN-V может быть обусловлено подавлением бактерий, ассоциированных с БВ, хотя настоящее исследование показало, что L. crispatus может оказывать прямое, но незначительное влияние на концентрации растворимого Е-кадгерина и IP-10.
В обсервационных исследованиях БВ был связан со сниженной вагинальной концентрацией IP-10 [10, 25]; это позволяло предположить, что либо отсутствие бактерий, ассоциированных с бактериальным вагинозом, либо присутствие видов Lactobacillus может стимулировать продукцию IP-10 [10]. V. Joag и соавт. [11] показали, что успешное лечение БВ антибиотиками, приводящее к преобладанию в вагинальном микробиоме L. iners, увеличивает вагинальные концентрации нескольких хемокинов через 1 мес, включая IP-10 и MIG. В настоящем исследовании авторы приводят доказательства того, что сниженные концентрации растворимого E-кадгерина и повышенные концентрации IP-10, наблюдаемые среди участниц, получавших LACTIN-V, были частично связаны с повышенным содержанием штаммов L. crispatus, не относящихся к CTV-05. Эти результаты позволяют предположить, что L. crispatus, штамм CTV-05 (LACTIN-V), может снижать воспаление в области половых органов и положительно влиять на целостность эпителиального барьера, не вызывая повышения уровня провоспалительных хемокинов, так же, как и штаммы L. crispatus, не относящиеся к CTV-05. Важно отметить, что штамм CTV-05 был обнаружен у 1 участницы, получавшей плацебо, вероятно, потому, что штамм CTV-05, обнаруживаемый в препарате LACTIN-V, получен из встречающегося в природе вагинального штамма L. crispatus.
У настоящего исследования имеется несколько ограничений. Во-первых, обследование на ИППП обычно выполняли при скрининге, но впоследствии тестирование проводили только в том случае, если у женщин проявлялись симптомы. Таким образом, авторы не смогли контролировать наличие бессимптомных ИППП во время исследования, что могло повлиять на иммунологические параметры слизистой половых органов при визитах последующего наблюдения. Тем не менее авторы прогнозировали низкий уровень заболеваемости ИППП, поскольку у всех участниц на пробном скрининге был получен отрицательный результат обследования на ИППП. Диагностику проводили в контексте любых симптомов со стороны половых органов, к тому же общий уровень 6-месячной заболеваемости ИППП у сексуально активных женщин в США довольно низкий [30]. Во-вторых, при каждом посещении не регистрировали стадию менструального цикла, за исключением самих менструаций. Хотя во время менструации не проводилось каких-либо визитов, предусмотренных исследованием, это ограничение снизило возможности авторов контролировать колебания уровня половых гормонов, что является потенциальным фактором, определяющим иммунологические параметры слизистой половых органов. В-третьих, для выявления связи концентраций IP-10 со штаммами L. crispatus, не относящимися к CTV-05, использовали целевую кПЦР, а не секвенирование гена 16S рРНК или метагеномное секвенирование, что ограничивало возможности исследователей оценивать микробиоту влагалища и выявлять вклад других микроорганизмов. В-четвертых, исследуемая популяция состояла только из американских женщин, хотя и представляла собой неоднородную когорту с точки зрения этнической принадлежности. Наконец, в иммунологических анализах участвовала подгруппа женщин, выполнявших все визиты, предусмотренные исследованием, в рамках проведения более крупного клинического исследования, в котором применялись строгие критерии отбора [20]. Поэтому, хотя авторы полагают, что полученные результаты отражают причинно-следственную связь между применением препарата LACTIN-V и иммунологическими параметрами в области половых органов, их следует рассматривать как гипотезообразующие. Чтобы обеспечить обобщаемость и окончательно показать причинно-следственную связь, необходимы дальнейшие исследования.
Тесная связь между вагинальной микробиотой и риском заражения ВИЧ позволяет предположить, что стимулирование преобладания L. crispatus в составе вагинальной микрофлоры может снизить риск заражения ВИЧ. Было показано, что лечение препаратом LACTIN-V после приема стандартных антибиотиков уменьшает частоту рецидивов БВ по сравнению с плацебо даже через 3 мес после получения последней дозы [20]. В настоящем исследовании авторы показали, что лечение препаратом LACTIN-V также было связано с устойчивым снижением уровня биомаркеров воспаления в области половых органов и повреждения эпителиального барьера за счет увеличения численности L crispatus и снижения численности видов Prevotella и Megasphaera. Кроме того, применение препарата LACTIN-V было связано с повышенными концентрациями провоспалительного хемокина IP-10, хотя этот показатель, по-видимому, был обусловлен штаммами L. crispatus, не относящимися к CTV-05, а не L. crispatus, штамм CTV-05. Необходима дальнейшая работа, чтобы определить, может ли применение препарата LACTIN-V после лечения стандартными антибиотиками снизить риск заражения ВИЧ в группе женщин высокого риска.
Вклад авторов. Разработка дизайна исследования - Каул Р., Армстронг Э., Коэн К.Р. и Хеммерлинг А.; проведение исследования - Хеммерлинг А., Миллер С., Моррис Ш.Р., Бурке К.Э., Ньюманн С.Дж., Рено Х. и Коэн К.Р.; проведение иммунологических анализов - Армстронг Э. и Хюбнер С.; анализ микробиома - Армстронг Э., Кобурн Б. и Куликова М.; анализ данных - Армстронг Э., Каул Руперт, Кобурн Б. и Нагелькерке Н.; интерпретация результатов исследования - Армстронг Э., Каул Р., Коэн Крэйг Р., Хеммерлинг А. и Кобурн Б.
Все авторы проверили рукопись. Все авторы имели полный доступ ко всем данным исследования и брали на себя обязательство предоставить их для публикации. Армстронг Э. и Каул Р. имели доступ ко всем данным исследования и проверили их.
Декларация конфликта интересов. Коэн К.Р. является председателем научно-консультативного совета компании Osel. Кобурн Б. сообщил о выделенных грантах от фонда Western Foundation, Канадских институтов исследований в области здравоохранения, Канадского онкологического общества, Фонда McLaughlin Foundation, Национального института рака и Фонда муковисцидоза; а также материальные поступления для исследований от компании Nubiyota. Крэйг Р. Коэн сообщил о грантах от Национальных институтов здравоохранения (NIH), Национального института аллергии и инфекционных заболеваний и Национального института здоровья детей и развития человека NIH (HHSN2722013000141 и HHSN27200007); также он владеет опционами на акции компаний Osel и Evvy. Каул Р. сообщил о гранте Канадского института исследований в области здравоохранения (#PJT-156123). Все остальные авторы заявляют об отсутствии конкурирующих интересов.
Обмен данными. Запрос данных должен быть отправлен автору для корреспонденции. Полный протокол клинического исследования доступен по ссылке https://www.clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT02766023.
Благодарности. Авторы благодарят всех участников исследования за участие в нем. Также они благодарят М.-К.Перри (Marie-Christine Perry) и Р. Лю (Rachel Liu) за техническую помощь в анализе количественной ПЦР; Э. Кроуфорд (Emily Crawford) и Г. Кастанеду (Gloria Castaneda) за организацию доставки образцов и логистику.
Литература/References
1. Low N., Chersich M.F., Schmidlin K., et al. Intravaginal practices, bacterial vaginosis, and HIV infection in women: individual participant data meta-analysis. PLoS Med. 2011; 8: e1000416.
2. Atashili J., Poole C., Ndumbe P.M., Adimora A.A., Smith J.S. Bacterial vaginosis and HIV acquisition: a meta-analysis of published studies. AIDS. 2008; 22: 1493-501.
3. Ravel J., Gajer P., Abdo Z., et al. Vaginal microbiome of reproductive- age women. Proc Natl Acad Sci USA. 2011; 108 (suppl 1): 4680-87.
4. McKinnon L.R., Achilles S.L., Bradshaw C.S., et al. The evolving facets of bacterial vaginosis: implications for HIV transmission. AIDS Res Hum Retroviruses. 2019; 35: 219-28.
5. Nold C., Anton L., Brown A., Elovitz M. Inflammation promotes a cytokine response and disrupts the cervical epithelial barrier: a possible mechanism of premature cervical remodeling and preterm birth. Am J Obstet Gynecol. 2012; 206: 208.e1-7.
6. Anton L., Sierra L.J., DeVine A., et al. Common cervicovaginal microbial supernatants alter cervical epithelial function: mechanisms by which Lactobacillus crispatus contributes to cervical health. Front Microbiol. 2018; 9: 2181.
7. Gosmann C., Anahtar M.N., Handley S.A., et al. Lactobacillus-deficient cervicovaginal bacterial communities are associated with increased HIV acquisition in young South African women. Immunity. 2017; 46: 29-37.
8. Arnold K.B., Burgener A., Birse K., et al. Increased levels of inflammatory cytokines in the female reproductive tract are associated with altered expression of proteases, mucosal barrier proteins, and an influx of HIV-susceptible target cells. Mucosal Immunol. 2016; 9: 194-205.
9. Masson L., Passmore J.A.S., Liebenberg L.J., et al. Genital inflammation and the risk of HIV acquisition in women. Clin Infect Dis. 2015; 61: 260-69.
10. Masson L., Mlisana K., Little F., et al. Defining genital tract cytokine signatures of sexually transmitted infections and bacterial vaginosis in women at high risk of HIV infection: a cross-sectional study. Sex Transm Infect. 2014; 90: 580-7.
11. Joag V., Obila O., Gajer P., et al. Impact of standard bacterial vaginosis treatment on the genital microbiota, immune milieu, and ex vivo human immunodeficiency virus susceptibility. Clin Infect Dis. 2019; 68: 1675-83.
12. McClelland R.S., Lingappa J.R., Srinivasan S., et al. Evaluation of the association between the concentrations of key vaginal bacteria and the increased risk of HIV acquisition in African women from five cohorts: a nested case-control study. Lancet Infect Dis. 2018; 18: 554-64.
13. Srinivasan S., Richardson B.A., Wallis J., et al. Vaginal microbiota and HIV acquisition risk among African women. In: Conference on Retroviruses and Opportunistic Infections. Boston, MA, March 4-7, 2018: Abstr 268.
14. Anahtar M.N., Byrne E.H., Doherty K.E., et al. Cervicovaginal bacteria are a major modulator of host inflammatory responses in the female genital tract. Immunity. 2015; 42: 965-76.
15. Ojala T., Kankainen M., Castro J., et al. Comparative genomics of Lactobacillus crispatus suggests novel mechanisms for the competitive exclusion of Gardnerella vaginalis. BMC Genomics. 2014; 15: 1070.
16. Bradshaw C.S., Morton A.N., Hocking J., et al. High recurrence rates of bacterial vaginosis over the course of 12 months after oral metronidazole therapy and factors associated with recurrence. J Infect Dis. 2006; 193: 1478-86.
17. Yang S., Reid G., Challis J.R.G., et al. Effect of oral probiotic Lactobacillus rhamnosus GR-1 and Lactobacillus reuteri RC-14 on the vaginal microbiota, cytokines and chemokines in pregnant women. Nutrients. 2020; 12: 368.
18. Happel A.U., Singh R., Mitchev N., et al. Testing the regulatory framework in South Africa - a single-blind randomized pilot trial of commercial probiotic supplementation to standard therapy in women with bacterial vaginosis. BMC Infect. Dis. 2020; 20: 491.
19. Bisanz J.E., Seney S., McMillan A., et al. A systems biology approach investigating the effect of probiotics on the vaginal microbiome and host responses in a double blind, placebo-controlled clinical trial of post-menopausal women. PLoS One. 2014; 9: e104511.
20. Cohen C.R., Wierzbicki M.R., French A.L., et al. Randomized trial of LACTIN-V to prevent recurrence of bacterial vaginosis. N Engl J Med. 2020; 382: 1906- 15.
21. Mohammadi A., Bagherichimeh S., Perry M.C., et al. The impact of cervical cytobrush sampling on cervico-vaginal immune parameters and microbiota relevant to HIV susceptibility. Sci Rep. 2020; 10: 8514.
22. Baron R.M., Kenny D.A. The moderator-mediator variable distinction in social psychological research: conceptual, strategic, and statistical considerations. J Pers Soc Psychol. 1986; 51: 1173-82.
23. Sabo M.C., Lehman D.A., Pintye J.C., et al. Elevation of cervical C-X-C motif chemokine ligand 10 levels is associated with HIV-1 acquisition in pregnant and postpartum women. AIDS. 2020; 34: 1725-33.
24. Wang Z., He Y., Zheng Y. Probiotics for the treatment of bacterial vaginosis: a meta-analysis. Int J Environ Res Public Health. 2019; 16: e3859.
25. Shannon B., Gajer P., Yi T.J., et al. Distinct effects of the cervicovaginal microbiota and herpes simplex type 2 infection on female genital tract immunology. J Infect Dis. 2017; 215: 1366-75.
26. Gajer P., Brotman R.M., Bai G., et al. Temporal dynamics of the human vaginal microbiota. Sci Transl Med. 2012; 4: 132ra52.
27. Happel A.U., Kullin B., Gamieldien H., et al. Exploring potential of vaginal Lactobacillus isolates from South African women for enhancing treatment for bacterial vaginosis. PLoS Pathog. 2020; 16: e1008559.
28. Hearps A.C., Tyssen D., Srbinovski D., et al. Vaginal lactic acid elicits an anti-inflammatory response from human cervicovaginal epithelial cells and inhibits production of pro-inflammatory mediators associated with HIV acquisition. Mucosal Immunol. 2017; 10: 1480-90.
29. Delgado-Diaz D.J., Tyssen D., Hayward J.A., Gugasyan R., Hearps A.C., Tachedjian G. Distinct immune responses elicited from cervicovaginal epithelial cells by lactic acid and short chain fatty acids associated with optimal and non-optimal vaginal microbiota. Front Cell Infect Microbiol. 2020; 9: 446.
30. Kreisel K.M., Spicknall I.H., Gargano J.W., et al. Sexually transmitted infections among US women and men: prevalence and incidence estimates, 2018. Sex Transm Dis. 2021; 48: 208-14.