В настоящее время исследования микробиоты кишечника человека становятся все более актуальными [1-3]. Микробиота кишечника человека формируется с момента внутриутробного зарождения кишечника и вплоть до смерти человека остается динамически изменяющейся системой, влияющей на все основные физиологические процессы организма человека. Нарушение становления микробиоты любой локализации (кишечник, влагалище, кожа и т.д.) или изменение уже сформировавшегося устойчивого микроценоза за счет ятрогенных, инфекционных воздействий, изменений гормонального статуса, в том числе возрастного, морфофункциональных особенностей строения органов и тканей влечет за собой каскад биохимических реакций, способствующих развитию патологических процессов, многогранных по патофизиологии и клиническим проявлениям.
Особое внимание заслуживает изучение микробиоты кишечника новорожденных. В современных условиях характер микробной колонизации кишечника, в том числе у новорожденных, претерпел существенные изменения в связи с увеличением контингента женщин с осложненным течением беременности, ростом стрессовых воздействий, экологическим неблагополучием и бесконтрольным применением антибиотиков [4-6]. Изучение становления микробиоты кишечника новорожденных позволяет, с одной стороны, получить новые знания о влиянии микробиоты кишечника на процессы нормального развития и здоровье ребенка, а с другой - своевременно выявлять проблемы становления кишечной микробиоты и разрабатывать пути ее коррекции. Известно, что самые значимые проблемы становления кишечной микробиоты наблюдаются у недоношенных новорожденных [7]. Известно, что нарушения становления микробиоты кишечника могут привести к сепсису, некротическому энтероколиту (НЭК) и синдрому системной воспалительной реакции [8]. Показано, что у недоношенных детей с очень низкой массой тела наблюдается уменьшение разнообразия микробиоты кишечника и более высокая патогенная нагрузка [7, 9].
Одной из главных проблем, стоящих перед исследователями, занимающихся изучением микробиоты кишечника новорожденных, является корректная и при этом относительно быстрая видовая идентификация большого количества изолятов микроорганизмов, а большинство из них трудно идентифицируются или не идентифицируются классическими бактериологическими методами бактериями. В течение последних десятилетий широкое распространение получили молекулярно-генетические технологии, и среди них особого внимания заслуживают методики высокопроизводительного секвенирования. При этом используются либо методики, направленные на секвенирование участков гена 16S рРНК, либо метагеномный анализ. Секвенирование позволяет выявлять некультивируемые или труднокультивируемые виды микроорганизмов, как правило, с его помощью можно проводить идентификацию тех или иных таксонов, но не все обнаруженные микроорганизмы идентифицируются до уровня видов. Так как при изучении микробиоты кишечника большое значение имеет видовая идентификация микроорганизмов, особенно бифидобактерий и лактобацилл, культуральные методы имеют определенное преимущество. Кроме того, секвенирование не позволяет определить жизнеспособность обнаруженных микроорганизмов: могут быть выявлены участки ДНК нежизнеспособных бактерий, не способных существовать в условиях кишечника.
Другие группы молекулярно-генетических методов: полимеразная цепная реакция (ПЦР) и биочипы, - селективные методы, позволяющие определять только те микроорганизмы, для которых известны специфические для них нуклеотидные последовательности, что ограничивает использование этих методов для изучения микробиоты кишечника.
Первые исследования микробиоты кишечника были выполнены с помощью культуральных методов путем проведения морфологических и биохимических тестов [7]. Однако такие тесты времязатратны и дороги. Секвенирование участков гена 16S рРНК, проводимое для чистых культур, в настоящее время является "золотым стандартом" видовой идентификации бактерий, но имеет высокую себестоимость.
В последние годы для решения стратегических вопросов современной микробиологии мощным инструментом в руках ученых становится метод времяпролетной масс-спектрометрии (MALDI-TOF-MS), ставший абсолютной альтернативой классической биохимической и молекулярно-генетической диагностики. MALDI-TOF-MS - это автоматизированная молекулярная платформа, которая представляет собой быстрый, простой и недорогой метод видовой идентификации бактериальных и грибковых микроорганизмов [10, 11]. На основе масс-спектрометрии их видовая идентификация может быть выполнена в срок, не превышающий нескольких минут, в то время как обычный анализ занимает от нескольких часов до более 2 сут. Однако остается дискуссионным вопрос о том, можно ли использовать метод MALDI-TOF-MS для эффективной видовой идентификации микроорганизмов при исследованиях микробиоты кишечника новорожденных.
Цель исследования - провести сравнительный анализ эффективности видовой идентификации микроорганизмов при исследованиях микробиоты кишечника новорожденных с помощью двух различных методов: MALDI-TOF-MS и секвенирования участков гена 16S рРНК.
Материал и методы
Исследования микробиоты кишечника проводили на группе новорожденных из различных отделений ФГБУ "НМИЦ АГП им. академика В.И. Кулакова" Минздрава России в 2019 г. Всем новорожденным выполнены клинические анализы крови и мочи для исключения инфекционной патологии или других факторов, способных повлиять на формирование микробиоты кишечника. У новорожденных проводился 3-кратный отбор проб фекалий: в 1-е сутки, конце 1-й недели и конце 1-го месяца жизни. Образцы мекония, полученного во время первой дефекации, или кала, собранные со стерильной пеленки в стерильный пластиковый контейнер, в течение 2 ч доставляли в лабораторию и незамедлительно приступали к посеву.
Изучение состава микробиоты кишечника новорожденных проведено методом культуромики - с использованием расширенного спектра селективных и неселективных питательных сред и инкубированием в аэробных, микроаэрофильных и анаэробных условиях. Посев мекония и кала проводили согласно принятым методикам [5, 12]. Для выделения факультативно-анаэробных и аэробных микроорганизмов использовали колумбийский кровяной агар, хромогенную среду Brilliance, сальмонелла-шигелла-агар, декстрозный агар Сабуро (Oxoid, Великобритания), маннитсолевой агар (Himedia, Индия), среду для выявления и дифференциации Streptococcus agalactiae (CHROMagar, Франция), энтерококковый агар, агар Эндо (ФГУН "ГИЦПМ и Б", Оболенск, Россия). Лактобациллы культивировали на среде лакто-бакагар (ФГУН "ГИЦПМ и Б", Оболенск, Россия). Строгие анаэробы выделяли на агаре для бифидобактерий (Himedia, Индия), прередуцированном агаре Шедлера с необходимыми добавками, основном агаре для анаэробов, перфрин-генс агаре, железосульфитном агаре, селективном агаре для Clostridium difficile (Oxoid, Великобритания). Для культивирования микроаэрофилов использовали СО2-инкубатор (Jouan, Франция) с концентрацией СО2 = 5%. Строгие анаэробы культивировали в анаэробном боксе (Jouan, Франция) в атмосфере 3-компонентной газовой смеси (N2 - 80%; CO2 - 10%; Н2 - 10%). Для контроля стерильности использовали тиогликолевый бульон (Oxoid, Великобритания).
Для исследования брали все выделенные в ходе работы чистые культуры микроорганизмов. Идентификацию микроорганизмов осуществляли с помощью двух различных методов: MALDI-TOF-MS и секвенирования гена 16S рРНК.
MALDI-TOF-MS анализ проводили следующим образом. Суточные культуры микроорганизмов (1-2 колонии) наносили на ячейки стальной мишени, подсушивали в течение 1-2 мин, затем сверху наслаивали 2 мкл насыщенного раствора матрицы. В качестве матрицы применяли альфа-циано-4-гидроксикоричную кислоту (Bruker Daltonics, Германия) в виде насыщенных растворов в смеси 50% ацетонитрила, 2,5% три-фторуксусной кислоты. Все использованные реактивы, включая воду, были аналитической чистоты или специальными для масс-спектрометрии. Кристаллы оставляли на воздухе в течение 5-10 мин до полного высыхания. Влажность и температуру при этом не контролировали. Масс-спектрометрический анализ осуществляли с помощью времяпролетного MALDI масс-спектрометра Autoflex III (Bruker Daltonics, Германия). Для записи, обработки и анализа масс-спектров использовали программное обеспечение MALDI BioTyper версии 3.0 (Bruker Daltonics, Германия). При значениях SCORE 1,60 и ниже видовую идентификацию считали недостоверной.
Секвенирование видоспецифических участков гена 16S рРНК осуществляли следующим образом: ДНК-культуры выделяли с использованием набора реагентов ДНК "Проба-ЦиТо" ("ДНК-технология"). Для секвенирования использовали 2 фрагмента ДНК: ампликон длиной ~440 п.н., соответствующий позициям 339-785 гена 16S рРНК, и ампликон длиной ~1340 п.н., соответствующий позициям 42-1380 гена 16S рРНК. Амплификацию проводили с использованием детектирующего амплификатора ДТпрайм ("ДНК-технология"). Секвенирование осуществляли на приборе 3130 Genetic Analyzer с использованием набора BigDye™ Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit согласно протоколу производителя. Для видовой идентификации использовали программный пакет BLAST [13].
Результаты видовой идентификации чистых культур, полученные секвенированием видоспецифических участков гена 16S рРНК, сравнивались с результатами, полученными методом MALDI-TOF-MS анализа.
Результаты
Для исследования отобрано 84 чистые культуры микроорганизмов, выделенные из фекалий новорожденных. Для каждого выделенного изолята проведено MALDI-TOF-MS исследование. Результаты видовой идентификации чистых культур микроорганизмов приведены в табл. 1. Для 69 (82%) изолятов получены значения показателя SCORE в диапазоне от 1,68 до 2,40, что дало возможность отнести каждый изолят к тому или иному предполагаемому виду. Для 15 (18%) изолятов микроорганизмов корректно видовую идентификацию провести не удалось.
)
)
)
Для каждого изолята выполнено секвенирование видоспецифических участков гена 16S рРНК. Результаты видовой идентификации, полученные путем секвенирования видоспецифических участков гена 16S рРНК, приведены в табл. 1.
Для всех 15 изолятов микроорганизмов, для которых видовую идентификацию методом MALDI-TOF-MS анализа провести не удалось, путем секвенирования получена видовая идентификациия. Изоляты микроорганизмов относились к следующим видам: Lactobacillus gasseri, Bifidobacterium bifidum (2 изолята), Cutibacterium acnes, Bifidobacterium longum, Globicatella sanguinis, Aerococcus spp., Streptococcus mutans, Veilonella atypica, Lactobacillus fermentum (2 изолята), Enterococcus faecalis (3 изолята) и к комплексу видов: Bifidobacterium kashiwanohense/Bifidobacterium pseudocatenulatum/ Bifidobacterium catenulatum.
Результаты видовой идентификации исследуемых изо-ятов микроорганизмов, полученные обоими методами, полностью совпали для 58 из 69 изолятов (84%). Следует отметить, что в 5 случаях точную видовую принадлежность близкородственных микроорганизмов установить не удалось при использовании обоих методов. Как методом MALDI-TOF-MS анализа, так и с помощью секвенирования видоспецифических участков гена 16S рРНК невозможно точно определить близкородственные виды Lactobacillus casei и Lactobacillus paracasei, а также виды Bifidobacterium kashi-wanohense, Bifidobacterium pseudocatenulatum и Bifidobacterium catenulatum; и виды Streptococcus mitis и Streptococcus oralis, их только можно отнести к группе, включающей 2-3 вида микроорганизмов.
Однако в 16% случаев (11 трудноидентифицируемых изолятов) определение вида микроорганизмов с помощью MALDI-TOF-MS прошло некорректно, и только секвенирование видоспецифических участков гена 16S рРНК позволило получить правильный результат. Следует отметить, что значения показателя SCORE в этих случаях были невысокими: для 9 изолятов они находились в диапазоне 1,68-1,98 и лишь в 2 случаях показатель SCORE составил 2,00-2,07.
В одном случае с помощью MALDI-TOF-MS был неправильно определен род микроорганизмов: Actinomyces odontolyticus со значением SCORE - 1,77. По результатам секвенирования определен Staphylococcus epidermidis. Возможно, в данном случае была смесь культур видов Actinomyces odontolyticus и Staphylococcus epidermidis.
В остальных случаях род микроорганизмов определен верно, но были ошибки видовой идентификации. В 5 случаях некорректно определены виды лактобацилл (род Lactobacillus), в 2 случаях - бифидобактерий (род Bifidobacterium), по одному случаю Veilonella, Eubacterium и Actinomyces. Следует отметить и сложность корректного определения Actinomyces даже с помощью секвенирования видоспецифических участков гена 16S рРНК: изолят Actinomyces, определенный с помощью MALDI-TOF-MS как A.oris, путем секвенирования определен как Actinomyces naeslundii или Actinomyces viscosus.
Обсуждение
Анализируя полученные данные, необходимо отметить, что результаты, полученные путем секвенирования видоспецифических участков гена 16S рРНК, хорошо коррелируют с результатами, полученными с помощью метода MALDI-TOF-MS анализа.
Для большей части изолятов (82%), включенных в исследование, получены значения показателя SCORE в диапазоне от 1,68 до 2,40, что дало возможность отнести каждый изолят к тому или иному предполагаемому виду. Для 15 (18%) изолятов микроорганизмов корректно видовую идентификацию провести не удалось. Результаты видовой идентификации исследуемых изолятов микроорганизмов, полученные обоими методами, полностью совпали для 84% изолятов.
В ряде случаев определение вида микроорганизмов с помощью MALDI-TOF-MS прошло некорректно, и только применение секвенирования видоспецифических участков гена 16S рРНК позволило получить правильный результат. Так как значения показателя SCORE в этих случаях были невысокими (для 9 изолятов они находились в диапазоне 1,68-1,98 и лишь в 2 случаях показатель SCORE составил 2,00-2,07), можно рекомендовать применение MALDI-TOF-MS при проведении исследований микробиоты кишечника новорожденных в качестве быстрого, недорогого и удобного метода видовой идентификации микроорганизмов.
Следует отметить, что в данной работе видовая идентификация на MALDI-TOF-MS проводилась без предварительной подготовки образцов. В частности, проведение экстракции чистых культур изолятов микроорганизмов, несомненно, улучшило бы результаты проводимых исследований. Но при исследованиях микробиоты кишечника человека проводится MALDI-TOF-MS большого количества выделенных изолятов "на потоке". Экстракция, проводимая для каждого изолята, существенно усложнит процедуру и увеличит время, затрачиваемое на проведение таких исследований.
Однако при низких значениях SCORE, полученных при проведении MALDI-TOF-MS, можно рекомендовать повторное проведение анализа, а также экстракцию чистой культуры микроорганизма.
В случае, когда повторное проведение MALDI-TOF-MS и анализа с предварительной подготовкой образцов не привело к увеличению показателя SCORE до значений 2,002,10, рекомендуется проведение секвенирования участков гена 16S рРНК. Секвенирование таких участков в настоящее время является "золотым стандартом" видовой идентификации бактерий, но имеет высокую себестоимость. Особенно хочется отметить не всегда корректное определение лактобацилл и бифидобактерий при низких значениях показателя SCORE. В данной работе в 5 случаях были некорректно определены виды лактобацилл и в 2 - бифидобактерий. Для таких случаев применение секвенирования представляется оправданным.
Следует отметить, что и секвенирование участков гена 16S рРНК не всегда однозначно позволяет определить видовую принадлежность изолята. В данной работе, например, невозможно точно определить близкородственные виды Lactobacillus casei и Lactobacillus paracasei, а также виды Bifidobacterium kashiwanohense, Bifidobacterium pseudocatenulatum и Bifidobacterium catenulatum; виды Streptococcus mitis и Streptococcus oralis, а также виды рода Actinomyces.
К сожалению, ни с помощью MALDI-TOF-MS, ни путем секвенирования используемого в работе участка гена 16S рРНК невозможно корректно определить подвид микроорганизмов вида Bifidobacterium longum. Корректное определение подвида Bifidobacterium longum необходимо для корректного анализа состава микробиоты кишечника, а также для выявления кандидатных в пробиотические штаммов микроорганизмов. Мы рекомендуем для дифференциации подвидов использовать ПЦР-методику, представленную в работе [14], а также использовать другие участки генов рибосомальных РНК.
Заключение
Проведен сравнительный анализ эффективности видовой идентификации микроорганизмов при проведении
исследований микробиоты кишечника новорожденных с помощью двух различных методов: MALDI-TOF масс-спектрометрии и секвенирования участков гена 16S рРНК. Результаты, полученные путем секвенирования видоспецифических участков гена 16S рРНК, хорошо коррелируют с результатами, полученными с помощью времяпролетного MALDI-TOF масс-спектрометра. Показано, что метод MALDI-TOF-MS анализа можно эффективно использовать при проведении исследований по изучению микробиоты кишечника новорожденных.