Dynamics of subpopulation structure of lymphocytes of peripheral blood at patients with a habitual abortion of alloimmunny genesis during pregnancy

• Nana K. Tetruashvili
• Lyubov V. Krechetova
• Saribegova V.A.
• Valentina V. Vtorushina
• Golubeva E.L.
• Khachatryan N.A.
• Agadzhanova A.A.

Abstract

In this study the authors estimated immunological indicators in women with idiopathic recurrent abortion (RA) after immunocytotherapy during all gestational period. The analysis of gestational complications and pregnancy outcomes was also conducted.

The aim of the study was to investigate NK cells, CD200+ and Treg-cells subpopulations dynamics, in patients with idiopathic RA during pregnancy, which developed after first-trimester immunocytotherapy.

Material and methods. The study included 100 patients with idiopathic RA. 49 of them became pregnant after prepregnancy immunocytotherapy (group with pregestational preparation, including 2 alloimmunization procedures); 23 patients became pregnant without pregestational preparation (group without pregestational preparation ). Also, in the study control group were included with 42 women of different gestational age. Phenotyping of peripheral blood lymphocytes was carried out. Blood for analysis was taken from pregnant women in fasting state from median cubital vein at 5-6 weeks of gestational age before alloimmunization, then at 8-9 weeks of gestational age after first alloimmunization procedure and before 2nd procedure, at 12 weeks of gestational age (3-4 weeks after 2nd alloimmunization procedure) and further during entire pregnancy at 16, 20, 25, 30, 34 and 37-38 weeks of gestational age.

Results. In women with adverse recent pregnancy outcome NK-cells subpopulations content was significantly lower than in control group, and in women with preterm labor in recent pregnancy Treg-cells content was also significantly lower than in control group. There were no differences in subpopulation composition of lymphocytes of patients with RA in prepregnancy preparation group and in control group (from 12 weeks of gestation) in contrast to patients with RA without prepregnancy preparation. It can be assumed that 2 alloimmunization procedures in I trimester is not enough for patients with recurrent abortion immune system recovery. Pregestational alloimmunization is necessary for patients with RA pregnancy preparation.

Conclusion. Immunization of pregnant women with sexual partner cells led to inflammatory responses balance and achievement the immune system state which promoted carrying of this pregnancy.

Keywords:habitual miscarriage, T-regulatory cells, CD200, homoimmune genesis, prepregnancy preparation, immunocyto- therapy

Идиопатический привычный выкидыш (ПВ) в структуре причин привычных потерь беремен­ности составляет 5-20%. Этиологию данного со­стояния в настоящее время связывают с нарушениями функционирования материнской иммунной системы, развивающей неадекватный ответ на отцовские анти­гены плода (аллоиммунные причины) [1]. По данным зарубежных авторов, шанс доносить беременность без терапии после 3 выкидышей, обусловленных аллоиммунными механизмами, составляет 30%, после 4 - 25%, после 5 - 5% [2, 3]. Своевременная диагностика и на­значение иммунокорригирующей терапии составляет основу тактики подготовки пациенток с идиопатическим ПВ к беременности. Установлено, что женщины с ПВ на ранних сроках гестации составляют группу риска, в ко­торой существенно повышена вероятность развития плацента-ассоциированных осложнений: плацентарной недостаточности, задержки роста плода, ранних пре­ждевременных родов, отслойки плаценты во II и в III триместрах беременности [4, 5]. В этой связи предгестационная подготовка представляет собой профилактику не только ранних потерь беременности, но и поздних гестационных осложнений. В настоящее время даже 2 по­следовательных выкидышей рассматриваются как осно­вание для постановки диагноза "привычный выкидыш", последующего обязательного обследования, в том числе иммунологического, и оптимизации подготовки к бере­менности [6].

Одним из вариантов иммуномодулирующей терапии является - иммуноцитотерапия (ИЦТ) - иммунизация женщин с ПВ аллогенными лимфоцитами партнеров. Показано, что ИЦТ в предгестационной подготовке спо­собствует формированию состояния иммунной системы, необходимого для успешной имплантации, а во время бе­ременности - для стимуляции развития плаценты и обе­спечения нормального развития эмбриона [7, 8]. ИЦТ ши­роко используется в России [9, 10] и за рубежом [11, 12], однако механизмы влияния аллоиммунизации на им­плантацию и последующую гестацию остаются мало­изученными. Оценка клеточных субпопуляций перифе­рической крови - необходимая составляющая анализа эффектов иммунокорригирующей терапии, поскольку ее главной целью является подавление агрессивных эффекторных реакций, в первую очередь связанных с увеличенным содержанием в периферической крови пациенток с ПВ субпопуляций клеток с естественной киллерной активностью.

Киллерные клетки с фенотипом CD56+, CD16+, CD3^-CD56CD16+,CD3^-CD8+ являются клетками врож­денного иммунитета. Цитотоксические клетки, по­являющиеся в эффекторной фазе иммунного ответа и имеющие фенотип CD3⁺CD8⁺ и CD3⁺CD56,CD16⁺, отно­сят к клеткам адаптивного иммунитета. Предполагает­ся, что в генезе привычного выкидыша большую роль играет нарушение взаимодействий NK-клеток (CD56+, CD16⁺) и клеток адаптивного иммунитета. Однако, не­смотря на довольно продолжительный период изуче­ния NK-клеток периферической крови в генезе ПВ, значимость их оценки для прогноза осложнений бере­менности остается невыясненной [13].

Особую значимость в последнем десятилетии приоб­рели исследования субпопуляции Т-регуляторных клеток с фенотипом CD4⁺ CD25⁺ и конститутивной экспрессией фактора Foхр3 (Трег). Считается, что Трег-специфическая иммуносупрессия способствует формированию толерант­ности, необходимой для реализации гестационных про­цессов в I триместре беременности [14]. В связи с этим об­суждается точка зрения, что целью иммунотерапии должна быть не иммуносупрессия, а стимуляция толерантности к аллоантигенам плода отцовского происхождения [15].

Показано, что важная роль в иммунорегуляции при­надлежит толерогенной молекуле CD200. В результате взаимодействия CD200 с рецепторами как дендритных клеток, так и клеток с естественной киллерной активно­стью индуцируется секреция индоламиндиоксигеназы, и они приобретают способность посредством продукции трансформирующего фактора роста β (ТФР β) стимулиро­вать генерацию Трег-клеток и, соответственно, индуци­ровать формирование специфической периферической толерантности [16-19].

Исследования, посвященные одновременной оценке динамики субпопуляций лимфоцитов периферической крови, включая субпопуляции с киллерной активностью, Трег и CD200+-клеток, в динамике беременности практи­чески не встречаются в доступной литературе.

Поэтому анализ субпопуляционного состава перифе­рической крови беременных с идиопатическим ПВ явля­ется актуальным для поиска иммунологических критери­ев прогноза развития беременности, особенно на фоне иммуномодулирующей терапии.

Цель данной работы - исследование динамики суб­популяций NK-клеток, CD200+ и Трег-клеток у пациенток с идиопатическим ПВ в течение беременности, раз­вивающейся после иммуноцитотерапии, проведенной в I триместре.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ

В исследование были включены пациентки с ПВ не­ясного генеза, имеющие в анамнезе 2 и более спонтанные потери беременности от одного партнера.

Критерии включения: подписание формы информи­рованного согласия на участие в исследовании, возраст женщины от 20 до 40 лет, самопроизвольное наступление беременностей, нормальный кариотип обоих партнеров, нормозооспермия у партнера, отсутствие анатомических, генетически обусловленных, аутоиммунных, гормональ­ных нарушений, препятствующих наступлению и вына­шиванию беременности, отсутствие тяжелых экстрагенитальных заболеваний.

Критерии исключения: отсутствие возможности паци­ентки продолжать исследование, нарушение требований протокола исследования, отягощенный аллергоанамнез.

Всего в исследование были включены 100 пациенток с идиопатическим ПВ, из них забеременевших после проведенной предгестационной иммуноцитотерапии (группа с предгестационной подготовкой, включающей 2 про­цедуры аллоиммунизации, группа СПП) - 49 пациенток; вступивших в беременность без предгестационной подго­товки (группа без предгестационной подготовки, группа БПП) - 23 пациентки. Также в исследование были вклю­чены 42 женщины контрольной группы с разными сро­ками физиологического течения беременности.

Предгестационная иммуноцитотерапия включала 2 курса аллоиммунизации лимфоцитами полового пар­тнера дважды с интервалом в 1 мес на 5-9-й день мен­струального цикла. При этом пациенткам внутрикожно вводили 50 млн клеток в ладонную поверхность предпле­чья в 10-12 точек.

В I триместре беременности аллоиммунизацию прово­дили всем 49 пациенткам с ПВ в анамнезе в сроке 5-6 и 8-9 нед беременности.

Кровь для анализа у беременных забирали натощак из локтевой вены в 5-6 нед гестации до аллоиммунизации, затем в 8-9 нед после 1-й процедуры аллоиммунизации и до 2-й процедуры, в 12 нед (через 3-4 нед после 2-й процедуры аллоиммунизации) и далее в течение всей беременности в 16, 20, 25, 30, 34 и 37-38 нед гестации.

Поверхностный фенотип клеток периферической крови определяли с помощью стандартного набора моноклональных антител (мАт), меченных флуоресцеинизотиоцианатом (ФИТЦ) или фикоэритрином (ФЭ), против антигенов CD3 (ФИТЦ), CD16 (ФЭ), CD56 (ФЭ), CD200 (ФЭ) (Becton Dickinson и eBioscience, США). Оценивали содер­жание CD200⁺-клеток, NK-клеток (CD56⁺, СD16⁺), а также содержание Трег.

Лимфоцитарный гейт, позволяющий исключить из анализа другие клетки крови, выявляли с помощью мАт к СD45, меченных перидинин-хлорофилл протеином (Per-CP) (Dako, Дания). Для оценки позитивно-окрашенных субпопуляций использовали соответствующие ФИТЦ или ФЭ-меченые изотипические IgG.

Субпопуляцию Трег-клеток с фенотипом СD4⁺CD25^high и внутриклеточной экспрессией транскрипционного фак­тора Foxp3+ определяли как субпопуляцию с поверхност­ным фенотипом СD4⁺CD25^highCD127^low/- [20]. Для оценки процентного содержания Трег-клеток использовали на­бор, содержащий моноклональные антитела к антиге­нам CD4, меченые Per-CP (eBioscience, США), CD25, мече­ные ФИТЦ (Becton Dickinson, США) и СD127, меченые ФЭ (eBioscience, США).

Моноклональные антитела добавляли непосредствен­но к цельной крови, затем лизировали с помощью раство­ра FACS Lysing Solution (Becton Dickinson, США). Анализ проводили с использованием проточного цитофлуориметра FACSСalibur (Becton Dickinson, США).

Статистическую обработку данных проводили общепринятыми методами вариационной статистики. Данные представлены как среднее ± ошибка среднего. Соответствие расчетных выборок показателей нормаль­ному распределению оценивали с помощью критерия Шапиро-Уилка с использованием статистического пакета MedCalc12 для Windows 7.

Значимость наблюдаемых отклонений средних значений измеренных параметров оценивали с помощью двухвыборочного t-критерия Стьюдента с различными дисперсиями для средних значений с использованием пакета статистиче­ского анализа для Microsoft Office Excel 2007. Различия счи­тали достоверными при уровне значимости р<0,05.

Для оценки диагностической значимости тестов фенотипирования лимфоцитов периферической крови жен­щин с привычным беременности выкидышем использова­ли ROC-анализ пакета MedCalc12 для Windows 7.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Динамика иммунологических параметров в течение беременности у пациенток с привычным выкидышем

На рис. 1 представлено содержание в перифериче­ской крови Трег и CD200⁺-клеток в разные сроки беремен­ности.

Как следует из представленных данных (см. рис. 1), содержание Трег в 8-9 нед гестации в обеих группах с ПВ значимо ниже, чем в контроле, а в 12 нед гестации значи­мо ниже только в крови беременных без предгестационной аллоиммунизации (группы БПП). Важно отметить, что в 37-38 нед (последнее обследование в сроке перед ро­дами) в группе БПП содержание Трег оказалось значимо выше, чем в контроле и в группе прошедших предгестационную подготовку (группа СПП).

Отличий в динамике Трег в группе СПП и в контрольной не отмечалось в течение всего периода наблюдения.

Содержание CD200⁺-клеток в 5-6 нед (до аллоиммунизации в I триместре) в группе с прегравидарной подго­товкой было значимо выше, чем в группах без проведения подготовки и контрольной, а в 8-9 нед - значимо выше, чем в контроле. После первой процедуры аллоиммунизации исчезли различия в содержании CD200⁺-клеток в группе СПП и БПП.

В 25 и 30 нед беременности содержание CD200+-клеток в группе без подготовки было значимо ниже, чем в контроле и в группе с проведением предгестационной подготовки. Различий в содержании CD200⁺-клеток в эти и в другие сроки в контрольной группе пациенток и в группе с подготовкой не выявлено.

На протяжении всего исследования во все сроки не обнаружено различий между обследованными группами в содержании NK-клеток с фенотипом CD3+CD16+ (рис. 2). Содержание NK-клеток с фенотипом CD3+CD56,16+ было выше в группе с предгестационной подготовкой, чем в контроле, только в 8-9 нед беременности, при этом со­держание с этой субпопуляции в группе без подготовки было одинаковым. Однако в течение беременности раз­личий между группами по данному показателю не выяв­лено (рис. 2).

Содержание субпопуляций NK-клеток различных фе­нотипов в течение беременности у пациенток с привыч­ным выкидышем представлено на рис. 3-5. Не обнару­жено различий в содержании NK-клеток с фенотипом CD3^-CD56,16+ между группами в разные сроки обследова­ния. Содержание общей популяции NK-клеток с феноти­пом CD56,16+ в группе без предгестационной подготовки было значимо выше, чем в группе с подготовкой в 34 нед беременности (рис. 3).

Содержание NK-клеток с фенотипом CD16+ в группе без прегравидарной подготовки в 8-9 нед беременно­сти было значимо выше, чем в контроле, а содержание NK-клеток с фенотипом CD3CD16+ в этой группе в 20 нед беременности было значимо ниже, чем в группах с под­готовкой и контрольной (рис. 4).

Содержание NK-клеток с фенотипом CD56+ в сроки гестации 5-6 и 8 9 нед в группе с прегравидарной подготов­кой было ниже, чем в группе без подготовки и в контроле, в 12, 16 и 20 нед беременности различия между группами не выявлялись, а в 25 и 34 нед содержание субпопуляции CD56+ в группе БПП было выше, чем в контроле (рис. 5).

Резюмируя исследования субпопуляционного соста­ва периферической крови беременных с ПВ, получавших терапию в прегравидарной подготовке с включением процедуры аллоиммунизации, и пациенток без предгравидарной аллоиммунизации, следует отметить, что, начи­ная с 12 нед беременности, т.е. через 3-4 недели после 2-й процедуры аллоиммунизации в I триместре, различий в содержании исследованных субпопуляций в группе с подготовкой и контрольной не выявлено. Наибольшее число отклонений в исследованных иммунологических показателях во II и в III триместрах беременности выяв­лено в группе пациенток, не получавших предгестационную подготовку.

Например, в группе БПП в 37-38 нед выявлено вы­сокое содержание Трег-клеток (в группе БПП - 10,4±0,7; в контроле - 7,3±0,4, р=0,014, в группе СПП 7,8±0,7, р=0,017).

В 25 и 30 нед беременности содержание CD200⁺-клеток было ниже, чем в контроле и в группе СПП (25 нед: в группе БПП - 4,8±0,8, в контроле - 8,0±0,4, р=0,0004, в группе СПП - 8,6±0,3, р=0,002; 30 нед: в группе БПП -4,9±0,3, в контроле - 6,6±0,5, р=0,010, в группе СПП -8,0±1,2, р=0,015).

В группе БПП содержание NK-клеток с фенотипом CD56,16⁺ в 34 нед было выше, чем в группе СПП (соответ­ственно 15,1±1,0 и 10,7±1,3, р=0,05), с фенотипом CD56+-клеток в 25 и 34 нед было выше, чем в контроле (25 нед: соответственно 18,3±2,0 и 13,8±1,8, р=0,048; 34 нед: со­ответственно 17,7±1,8 и 12,9±1,6, р=0,041), а с фенотипом CD3CD16+ в сроке 20 нед гестации было ниже, чем в груп­пах СПП и контрольной (в группе БПП - 3,4±1,3, в контро­ле - 12,2±1,6, р=0,0004, в группе СПП - 11,1±2,0, р=0,002).

Обобщая полученные результаты, можно утверждать, что различий в субпопуляционном составе лимфоци­тов пациенток с ПВ из группы СПП и женщин контроль­ной группы с 12 нед гестации в отличие от пациенток с ПВ БПП, не обнаружено. Можно предположить, что для нормализации состояния иммунной системы пациенток с привычным невынашиванием двух процедур аллоиммунизации в I триместре недостаточно, и предгестационная аллоиммунизация необходима для подготовки пациенток с ПВ к беременности.

Ретроспективный анализ иммунологических параметров в зависимости от исходов беременности у пациенток с привычным выкидышем

По исходам настоящей беременности были выделены 2 подгруппы пациенток ПВ: с осложнениями ранних сро­ков беременности (1-я подгруппа, n=17) и с осложнения­ми поздних сроков беременности (2-я подгруппа, n=16).

В 1-й подгруппе у 15 пациенток выкидыш состоялся до 11 нед гестации и у 2 пациенток - до 16 нед гестации.

Во 2-й подгруппе - у 1 пациентки в 28-29 нед разви­лась тяжелая преэклампсия, потребовавшая досрочного родоразрешения. В связи с прогрессированием плацен­тарной недостаточности и ухудшением состояния плода проведено родоразрешение в 29-30 нед беременности. В связи с преждевременным излитием околоплодных вод при дихориальной диамниотической двойне в 2 случаях проведено кесарево сечение в 35-36 нед, также при пре­ждевременном излитием околоплодных вод в 2 случаях проведено кесарево сечение в связи с конизацией шейки матки. В 1 случае родоразрешение проведено ввиду на­чала родовой деятельности и угрозы разрыва матки по рубцу. В 33-34 нед в 1 случае произошла антенатальная гибель плода. У 4 пациенток было проведено экстренное кесарево сечение в связи с нарастающей гипоксией пло­да в 35-36 нед. В остальных случаях развилась регуляр­ная родовая деятельность в 34-36 нед беременности.

На рис. 6 отражены результаты ретроспективного анализа исследованных иммунологических показателей в 5-6 нед (до аллоиммунизации в I триместре) в 1-й под­группе с целью выявления предикторов ранних потерь беременности.

Из данных, представленных на рис. 6, у пациенток с ПВ содержание субпопуляций NK-клеток было значи­мо ниже, чем у женщин с физиологически протекающей беременностью. Для показателей, значимо отличающихся от контрольных значений, проведена оценка диагности­ческой значимости тестов, представленная в табл. 1.

Как следует из табл. 1, специфичность определения ис­следованных субпопуляций NK-клеток одинакова (100%). Это означает, что при снижении содержания указанных по­казателей ниже критериальных значений будут выявляться все пациентки с угрозой потери беременности в I триместре, поскольку специфичность теста - вероятность того, что тест будет отрицательным, если пациент здоров. Чувствитель­ность тестов высокая, но максимальной чувствительностью обладает тест определения содержания субпопуляции CD3^-CD56,16+ (91,7%). Величина данного параметра означа­ет, что примерно у 8,3% пациенток с ПВ потери беременно­сти в I триместре может не быть.

На рис. 7 отражены результаты ретроспективного анализа исследованных иммунологических показателей в 12 нед беременности (через 3-4 нед после 2-кратной аллоиммунизации лимфоцитами партнеров в I триместре) во 2-й подгруппе с целью выявления предикторов поздних осложнений беременности, которые могут потребо­вать досрочного элективного родоразрешения.

Как следует из данных, представленных на рис. 7, различия обнаружены только в содержании Трег-клеток, которые в подгруппе с преждевременным родоразрешением оказались ниже, чем в контроле (6,0±0,5 и 8,0±0,5 соответственно, р=0,010). Проведенный расчет диагно­стической значимости определения Трег-клеток для про­гноза развития беременности показал, что при содержа­нии в периферической крови пациенток с ПВ Трег<7,5% в 12 нед беременности после проведенной аллоиммунизации в I триместре с чувствительностью 100% и специ­фичностью 61,5% можно прогнозировать развитие осложнений беременности, которые могут потребовать досрочного родоразрешения. Это означает, что у всех женщин с осложнениями, приводящими к досрочному родоразрешению, содержание Трег-клеток в перифе­рической крови будет ниже 7,5%, но примерно у 38,5% беременных с содержанием Трег-клеток ниже порогового значения такого исхода беременности можно не ожидать.

ОБСУЖДЕНИЕ

Использование иммуномодулирующей терапии для лечения ПВ аллоиммунного генеза не вызывает сомне­ний, и ее различные варианты насчитывают более чем 30-летнюю историю. В данной работе оценивали динами­ку субпопуляционного состава лимфоцитов перифериче­ской крови в течение всего гестационного периода.

По мнению многих авторов, в формировании толерант­ности матери по отношению к плоду Трег-клетки являют­ся важным участником, и их дефицит связывают с развитием ПВ [21]. Последние исследования показали, что Трег-клетки увеличены во время физиологической бере­менности, показана связь между снижением количества Трег-клетки и иммунологическим отторжением плода [22].

В основе реализации механизмов толерантности рас­сматривалось участие различных типов клеток, однако ведущая роль, по всей видимости, принадлежит Т-клеткам с фенотипом CD4+CD25+ и внутриклеточной экспрессией фактора Foхр3⁺ - Трег-клеткам [23, 24].

В ранее проведенных исследованиях было показано, что во время беременности увеличивается доля Tрег-клеток среди CD4⁺-клеток периферической крови и децидуальной оболочки матки в течение I и II триместров и уменьшается в послеродовом периоде [25, 26].

По результатам нашего исследования содержание Трег-клеток в 8-9 нед беременности в обеих группах с привычным выкидышем значимо ниже, чем в контроле, а в 12 нед беременности значимо ниже только в крови бе­ременных без предгестационной аллоиммунизации. Од­нако в 37-38 нед в группе без предгестационной подго­товки содержание Трег-клеток оказалось значимо выше, чем в контроле и в группе женщин, прошедших прегравидарную подготовку. Отличий в динамике Трег-клеток в группе с предгестационной подготовкой и в контроль­ной не отмечалось в течение всего периода наблюдения.

По результатам нашего исследования содержание Трег-клеток различия обнаружены у женщин с прежде­временными родами, где содержание Трег-клеток ока­залось значимо меньше, чем в контроле. Проведенный расчет диагностической значимости определения Трег-клеток для прогноза развития беременности показал, что при содержании в периферической крови пациенток с ПВ Трег ≤7,5% в 12 нед беременности после проведенной аллоиммунизации в I триместре с чувствительностью 100% и специфичностью 61,5% можно прогнозировать разви­тие осложнений беременности, которые могут потребо­вать досрочного элективного родоразрешения. Это озна­чает, что у всех женщин с осложнениями, приводящими к досрочному родоразрешению, содержание Трег в пе­риферической крови будет <7,5%, но примерно у 38,5% беременных с ПВ с содержанием Трег ниже порогового значения такого исхода беременности можно не ожидать. Следовательно, нельзя исключить, что иммунизация влия­ет на состояние активации лимфоцитов основных субпо­пуляций, что, в свою очередь, изменяет функциональные особенности Трег-клеток.

В нашем исследовании содержание CD200⁺-клеток в 5-6 нед (до аллоиммунизации в I триместре) в группе с предгестационной подготовкой было значимо выше, чем в группах без предгестационной подготовки и кон­трольной, а в 8-9 нед - значимо выше, чем в контроле. После 1-й процедуры аллоиммунизации исчезли разли­чия в содержании CD200⁺-клеток в группе с предгестационной подготовкой и без нее.

В 25 и 30 нед беременности содержание CD200+-клеток в группе без предгестационной подготовки было значимо ниже, чем в контроле и в группе с предгестационной подготовкой. Различий в содержании CD200⁺-клеток в эти и в другие сроки в контрольной группе пациенток и в группе с предгестационной подготовкой не выявлено.

По данным некоторых исследований предполагается, что в основе потерь беременности на ранних сроках ле­жит нарушение взаимодействия NK-клеток (CD56+, CD16+) и клеток адаптивного иммунитета. Однако, несмотря на довольно продолжительный период изучения NK-клеток периферической крови в этиологии ПВ, их значимость оценки для прогноза ранней беременности не выяс­нена [27, 28].

Клетки с естественной киллерной активностью (NK-клетки) и фенотипом CD56+, CD16+, CD3^-CD56,16+, CD3CD8+ являются клетками врожденного иммунитета, обладают цитотоксической функцией.

В нашем исследовании содержание NK-клеток с фе­нотипом CD3+CD16+, CD3+CD56,16+, CD3^-CD56,16+ не отлича­лось от содержания данных клеток в группах на протяже­нии всего исследования по срокам беременности.

В I триместре беременности в 5-6 и 8-9 нед после первой ИЦТ содержание NK-клеток с фенотипом CD56+ в группе с предгестационной подготовкой было ниже, чем в группе без предгестационной подготовки и в груп­пе контроля. Содержание NK-клеток с фенотипом CD16+ в 8-9 нед в группе без предгестационной подготовки наблюдалось выше, чем в группе контроля. В 12 нед со­держание CD56,16+ было выше в группе без предгестаци­онной подготовки, чем в группе с предгестационной под­готовкой.

Во II триместре в 20 нед беременности содержание NK-клеток с фенотипом CD3CD16 в группе без предгестационной подготовки было значимо ниже, также в 25 нед содержание CD56+ в группе без предгестацион­ной подготовки было выше, чем в группе контроля. Дан­ные показатели могут быть связаны с клинически диа­гностированной в данные сроки истмико-цервикальной недостаточностью, а также с результатами бактериологи­ческого и данных исследований с помощью полимеразной цепной реакции, по которым определялись воспали­тельные изменения. Проведена оценка диагностической значимости определения субпопуляцонного состава NK-клеток периферической крови женщин с ПВ в 5-6 нед. Как следует из проведенной оценки, специфичность определения исследованных субпопуляций NK-клеток одинакова (100%). Чувствительность тестов высокая, но максимальной чувствительностью обладает тест опреде­ления содержания субпопуляции CD3^-CD56,16+ (91,7%). Величина данного параметра означает, что примерно у 8,3% пациенток с ПВ потери беременности в I триме­стре может не быть.

В III триместре беременности в сроке 34-35 нед бе­ременности содержание NK-клеток с фенотипом CD56,16+ в группе женщин, не прошедших предгестационную под­готовку было выше, чем у женщин с предгестационной под­готовкой. Содержание NK-клеток с фенотипом CD56+ в дан­ной группе женщин было выше, чем в группе контроля.

Таким образом, субпопуляции клеток врожденного иммунитета с естественной киллерной активностью выше у женщин основной группы, чем в группе контроля.

Таким образом, по результатам данного исследования можно выделить несколько наиболее информативных NK-клеток с фенотипом CD56,16+, CD16+, CD3CD16, CD56+. Данные маркеры по результатам исследования показали наиболее динамические изменения в течении беремен­ности по исследуемым срокам. По-видимому, указанные популяции NK-клеток, играют роль в иммунорегуляции беременности. Надо отметить, что избыточная киллерная активность, связанная с увеличением содержания NK-клеток, могла быть компенсирована в присутствии Трег-клеток, оказывающих супрессивное воздействие на NK-клетки [29].

Указанные изменения могут свидетельствовать о до­стижении сбалансированного состояния иммунной си­стемы, которое способствовало вынашиванию данной бе­ременности.

Обобщая результаты исследования субпопуляционного состава периферической крови беременных с ПВ, ко­торые получали терапию в предгестационной подготовке с включением процедуры аллоиммунизации, и пациенток без предгестационной аллоиммунизации, можно отме­тить, что начиная со срока 12 нед беременности, т.е. через 3-4 нед после 2-й процедуры аллоиммунизации в I три­местре, различий в содержании исследованных субпопуляций в группе предгестационной подготовкой и кон­трольной не выявлено. Достоверно наибольшее число отклонений в исследованных иммунологических пока­зателях во II и в III триместрах беременности выявлено в группе пациенток без предгестационной подготовки.

В нашей работе исследована эффективность мето­дики иммуноцитотерапии аллогеными лимфоцитами на протяжении всего гестационного периода. Установлено, что у женщин основной группы своевременные роды про­изошли в 63,5% случаев, преждевременные роды -у 16,7% наблюдаемых женщин. В 15,6% наблюдений имели место ранние потери беременности до 12 нед, из 15 прервавшихся беременностей 5 были обусловлены аномальным кариотипом, что и стало основной причиной прерывания, в 2,1% произошли выкидыши с 12-й по 22-ю неделю беременности, в 2,4% проведено прерывание бе­ременности по медицинским показаниям.

Все вышеизложенное позволяет определить наи­более информативные иммунологические маркеры для оценки эффективности ИЦТ и предупреждения ранних прерываний беременности, диагностики поздних гестационных осложнений, что позволит оптимизировать ведение беременности для предотвращения преждевре­менных родов.

ЛИТЕРАТУРА_

1. Recurrent Pregnancy Loss: Causes, Controversies and Treatment/ ed. Carp Howard J.A. Informa UK Ltd.; 2007. 290 p.

2. Chong P.J., Matzner W.L., Ching W.T. Benefit of leukocyte immunizations? // Fertil. Steril. 1993. Vol. 59, N 1. P. 247-249.

3. Chong P.J., Matzner W.L., Ching W.T. Controversy about immunotherapy // Fertil. Steril. 1993. Vol. 59, N 5. P. 1138-1139.

4. Saraswat L., Bhattacharya S., Maheshwari A., Bhattacharya S. Maternal and perinatal outcome in women with threatened miscarriage in the first trimester: a systematic review // BJOG. 2010. Vol. 117, N 3. P. 245-257.

5. van Oppenraaij R.H., Jauniaux E., Christiansen O.B., Horcajadas J.A. et al.; ESHRE Special Interest Group for Early Pregnancy (SIGEP). Predicting adverse obstetric outcome after early pregnancy events and complications: a review // Hum. Reprod. Update. 2009. Vol. 15, N 4. P. 409-421.

6. Сидельникова В.М., Сухих Г.Т. Невынашивание беремен­ности : руководство для практикующих врачей. М. : Меди­цинское информационное агентство, 2011. 516 с.

7. Сухих Г.Т., Ванько Л.В. Иммунология беременности. М. : Изд-во РАМН;, 2003. 400 с.

8. Посиссева Л.В., Малышкина А.И., Бойко Е.Л., Сотникова Н .Ю. и др. Реабилитация репродуктивного здоровья су­пружеских пар с невынашиванием беременности. Ива­ново : Иваново, 2008. 240 с.

9. Петросян Л.А. Оптимизация лимфоцитоиммунотерапии в лечении привычной потери беременности первого три­местра : автореф. дис. . канд. мед наук. М., 2009. 24 с.

10. Khonina N.A., Broitman E.V., Shevela E.Y., Pasman N.M. et al. Mixed lymphocyte reaction blocking factors (MLR-Bf) as potential biomarker for indication and efficacy of paternal lymphocyte immunization in recurrent spontaneous abortion // Arch. Gynecol. Obstet. 2013. Vol. 288, N 4. P. 933-937.

11. Taro Nonaka, Koichi Takakuwa, Izumi Ooki, Mami Akashi et al. Results of Immunotherapy for Patients with Unexplained Primary Recurrent Abortions - Prospective Non-Randomized Cohort Study // Am. J. Reprod. Immunol. 2007. Vol. 58. P. 530-536.

12. Recurrent Miscarriage Immunotherapy Trialists Group. Worldwide collaborative observational study and meta­analysis on allogenic leukocyte immunotherapy for recurrent spontaneous abortion // Am. J. Reprod. Immunol. 1994. Vol. 32, N 3. P. 255.

13. Raghupathy R., Al-Mutawa E., Al-Azemi M., Makhseed M. et al. Progesterone-induced blocking factor (PIBF) modulates cytokine production by lymphocytes from women with recurrent miscarriage or preterm delivery // J. Reprod. Immunol. 2009. Vol. 80, N 1-2. P. 91-99.

14. Arck P., Hansen P.J., Mulac Jericevic B., Piccinni M.P. et al. Progesterone during pregnancy: endocrine-immune cross talk in mammalian species and the role of stress // Am. J. Reprod. Immunol. 2007. Vol. 58, N 3. P. 268-279.

15. Ku C.W., Allen J.C. Jr, Malhotra R., Chong H.C. et al. How can we better predict the risk of spontaneous miscarriage among women experiencing threatened miscarriage? // Gynecol. Endocrinol. 2015. Vol. 31, N 8. P. 647-651.

16. Hudic I., Stray-Pedersen B., Szekeres-Bartho J., Fatusic Z. et al. Maternal serum progesterone-induced blocking factor (PIBF) in the prediction of preterm birth // J. Reprod. Immunol. 2015. Vol. 109. P. 36-40.

17. Szekeres-Bartho J., Weill B.J., Mike G., Houssin D. et al. Progesterone receptors in lymphocytes of liver-transplanted and transfused patients // Immunol. Lett. 1989. Vol. 22. P. 259-261.

18. Сидельникова В.М. Подготовка и ведение беременности у женщин с привычным невынашиванием : методические пособия и клинические рекомендации. М. : МЕДпресс-информ, 2011. 224 с.

19. Chaouat G. Inflammation, NK cells and implantation: friend and foe (the good, the bad and the ugly?): replacing placental viviparity in an evolutionary perspective // J. Reprod. Immunol. 2013. Vol. 97, N 1. P. 2-13.

20. Nielsen H.S., Witvliet M.D., Steffensen R. et al. The presence of HLA-antibodies inrecurrent miscarriage patients is associated with a reduced chance of a live birth // J. Reprod. Immunol. 2010. Vol. 87, N 1-2. P. 67-73.

21. Saito S., Shima T., Nakashima A., Shiozaki A. et al. What is the role of regulatory T cells in the success of implantation and early pregnancy? // Assist. Reprod. Genet. 2007. Vol. 24. P. 379-386.

22. Somerset D.A., Zheng Y., Kilby M.D., Sansom D.M. et al. Normal human pregnancy is associated with an elevation in the immune suppressive CD25+CD4+ regulatory T-cell subset // Immunology. 2004. Vol. 112. P. 38-43.

23. Zenclussen A.C., Gelof K., Zenclussen M.L., Ritter T. et al. Abnormal T-cell reactivity against paternal antigens in spontaneous abortion: adoptive transfer of pregnancy-induced CD4+ CD25+ T regulatory cells prevents fetal rejection in a murine abortion model // Am. J. Pathol. 2005. Vol. 166. P. 811-822.

24. Shou Z., Xu Y., Xiao H., Zhou Q. et al. The effect of pregnancy on paternal skin allograft survival // Sci. China C. Life Sci. 2009. Vol. 52, N 11. P. 1011-1015.

25. Saito S., Sasaki Y., Sakai M. CD4+CD25+high regulatory T-cells in human pregnancy // J. Reprod. Immunol. 2005. Vol. 65, N 2. P. 111-120.

26. Somerset D.A., Zheng Y., Kilby M.D., Sansom D.M. et al. Normal human pregnancy is associated with an elevation in the immune suppressive CD25+ CD4+ regulatory T-cell subset // Immunology. 2004. Vol. 112, N 1. P. 38-43.

27. Chaouat G. Inflammation, NK cells and implantation: friend and foe (the good, the bad and the ugly?): replacing placental viviparity in an evolutionary perspective // J. Reprod. Immunol. 2013. Vol. 97, N 1. P. 2-13.

28. Li T.C., Markis M., Tomsu M. et al. Recurrent miscarriage: aetiology, management and prognosis // Hum. Reprod. Update. 2002. Vol. 104. P. 784-788.

29. Azuma T., Takahashi T., Kunisato A., Kitamura T. et al. Human CD4+ CD25+ regulatory T cells suppress NKT cell functions // Cancer Res. 2003. Vol. 63, N 15. P. 4516-4520.