Морфогистологические и иммуногистохимические особенности плаценты в группах риска по развитию преэклампсии

• Казанчи Фатима Байзетовна
• Андреева Маргарита Дарчоевна
• Веревкин Александр Александрович

Резюме

Цель исследования - оценить гистопатологическое состояние плаценты после завершения беременности при развитии преэклампсии; сравнить с результатами у здоровых беременных.

Материал и методы. Проведено проспективное исследование ткани плаценты в двух группах: 1-я (n=44) - беременные высокого риска по развитию преэклампсии (ПЭ) и 2-я группа (n=44) - группа сравнения - беременные низкого риска развития ПЭ. Проведены морфологическое и иммуногистохимическое (ИГХ) исследования ткани плаценты в обеих группах. Выполнено ИГХ-исследование с антителами к тромбоцитарно-эндотелиальным молекулам клеточной адгезии (PECAM-1, CD31) и эндоглину (CD105). Подсчет числа клеток проводили с использованием программы ImageJ. Рассчитывали коэффициент площади окрашивания (КПО).

Результаты. ИГХ-исследование показало: эндотелиальные клетки плацент беременных с ПЭ давали слабую положительную реакцию на PECAM-1, КПО тромбоцитарно-эндотелиальной молекулы клеточной адгезии составил 2,30% [1,51; 3,07]. Реакция на эндоглин была резко положительной, его экспрессия составила 6,61% [6,30; 7,04]. ИГХ-исследование плацент беременных без ПЭ: реакция с антителами к CD31 была положительной в большинстве кровеносных сосудов хориона, эндоглин присутствовал лишь в отдельных эндотелиальных клетках. Уровни экспрессии молекулы сосудистой адгезии CD31 (PECAM-1) во 2-й группе составили 7,11% [6,84; 7,50] и эндоглина - 3,17% [2,98; 3,51]. КПО тромбоцитарно-эндо­телиальной молекулы клеточной адгезии во 2-й группе составил 7,11% [6,84; 7,50], что статистически значимо превосходило уровни экспрессии в 1-й группе - 2,30% [1,51; 3,07] (статистически значимые отличия между группами, p=0,036). Экспрессия эндоглина в 1-й группе составила 6,61% [6,30; 7,04] и была статистически значимо выше показателя во 2-й группе - 3,17% [2,98; 3,51], р=0,014. Проведенный корреляционно-регрессионный анализ продемонстрировал сильную обратную связь между экспрессией CD31 и CD105 (r=-0,69, p=0,032).

Заключение. Низкие величины PECAM-1 в 1-й группе можно рассматривать как проявление эндотелиальной дисфункции, характерной для тяжелого повреждения сосудов с фибриноидным некрозом и тромбозами, что соответствует морфологии изучаемых срезов. Значительное содержание эндоглина в образцах у пациенток 1-й группы можно расценивать как своеобразное проявление регенерации эндотелия. ПЭ соответствует низкая экспрессия тромбоцитарно-эндотелиальной молекулы клеточной адгезии (р=0,036) и высокий уровень экспрессии эндоглина (р=0,014).

Ключевые слова: преэклампсия; плацента; иммуногистохимия

Введение

Известно, что развитие преэклампсии (ПЭ) связано с прогрессирующими мультисистемными расстройствами, которые сопровождаются протеинурией и гипертензией. Плохая перфузия плаценты может привести к гипоксии, недостаточному выбросу цитокинов, что ведет к повреждению эндотелиальных клеток и развитию дисфункции [1-8].

Хотя сегодня наше понимание патофизиологии ПЭ значительно продвинулось, единых взглядов на истинную этиологию не существует, в связи с чем ее продолжают называть "болезнью теорий". Нет единого понимания восприятия основных биологических механизмов на фоне наблюдаемой дисфункции ряда органов при ПЭ [9].

Данные анализа образцов плаценты человека, полученных от здоровых беременных, отличаются при сравнении с образцами пациенток с ПЭ. Сегодня широко развиваются направления, связанные с определением РНК в пределах ткани. Обнаружены различные РНК, которые соответствовали разным морфологическим структурам: были выявлены отличия по данному критерию при сравнении плацент от здоровых беременных с доношенным сроком с плацентами беременных с ПЭ [10, 11]. Изучается материнская мальперфузия, которая характеризуется нарушением роста плаценты и изменением морфологии дистальных отделов ворсин хориона. Плодная мальперфузия, или фетоплацентарная недостаточность, характеризуется затрудненным кровотоком в пуповине при пролонгировании беременности и связана с изменениями в сосудах хориона, что ведет к очаговым и фокальным изменениям [12-14]. Однако вызывает интерес, что является причиной материнской и плодной мальперфузии, которая характеризуется нарушением кровотока и приводит к ишемии.

В связи с вышесказанным для изучения морфологических и иммуногистохимических (ИГХ) изменений на уровне плаценты мы провели изучение плацент пациенток с ПЭ (1-я группа) и плацент здоровых беременных (без ПЭ - 2-я группа).

Цель исследования - оценить гистопатологическое состояние плаценты после завершения беременности при развитии ПЭ и сравнить с результатами у здоровых бере­менных.

Материал и методы

Проведено проспективное исследование ткани плаценты в 2 группах: 1-я группа (n=44) - беременные высокого риска по развитию ПЭ и 2-я группа (n=44) - группа сравнения - беременные низкого риска развития ПЭ. Все беременные наблюдались в условиях женских консультаций перинатальных центров г. Краснодара на базах ГБУЗ "ККБ № 2" Минздрава Краснодарского края и ГБУЗ "ДККБ" Минздрава Краснодарского края.

Критерии включения в исследование: возраст 18-42 года, одноплодная беременность, подписанное информированное согласие.

Критерии невключения: возраст моложе 18 и старше 42 лет, многоплодная беременность; критерий только для группы сравнения - наличие преждевременных родов или мертворождений в анамнезе, индекс массы тела (ИМТ) 35,0 кг/м² и выше, артифициальные и самопроизвольные аборты в анамнезе, тяжелая экстрагенитальная и гинекологическая патология, пациентки с ВИЧ-позитивным статусом, хроническими вирусными гепатитами и/или с сифилисом в анамнезе либо с высоким риском инфицирования, отсутствием желания участвовать в исследовании.

Критерии исключения: самопроизвольный выкидыш на сроках до 20 нед настоящей беременности, развитие значимых клинических событий, не связанных с проводимым исследованием, отсутствие информации о беременной, отзыв информированного согласия, значимое отклонение от протокола исследования.

После рождения ребенка и последа проведено морфологическое и ИГХ-исследование ткани плаценты в обеих группах. Методика гистологического исследования образцов плаценты выполнялась по следующему алгоритму: гистологическая проводка материала путем его фиксации в забуференном формалине, этаноле, абсолютном этаноле/ксилоле, ксилоле при соответствующей временной и температурной экспозиции. Этапы дегидратирования выполняли при помощи автоматического гистопроцессора TP1020 (Leica, ФРГ). Заливку в парафин выполняли при помощи модульной установки EG1150H (Leica, ФРГ). На ротационном микротоме RM2235 (Leica, Германия) были получены парафиновые срезы толщиной 5 мкм с проведением последующей депарафинизации, гидратации, окрашивания гематоксилином и эозином (Histolab, Швеция). Депарафинированные стекла помещали в термостат с температурой 60 °С на 10-20 мин с последующей последовательной экспозицией в ксилоле и этаноле. Затем их ополаскивали в воде и переносили в трис-солевой буфер.

Выполняли ИГХ-исследование с антителами к тромбоцитарно-эндотелиальным молекулам клеточной адгезии (PECAM-1, CD31) и эндоглину (CD105). Подсчет числа клеток проводили при увеличении ×400 с автоматическим вычислением с использованием программы ImageJ. Рассчитывали коэффициент площади окрашивания (КПО), представляющий собой отношение площади, занимаемой иммунореактивным цветным продуктом, к общей площади среза. Морфологический раздел работы выполнен в лаборатории фундаментальных исследований в области регенеративной медицины Кубанского государственного медицинского университета.

Статистическая обработка данных проведена посредством статистического пакета Statistica 13.3 (Tibco, США). Данные охарактеризованы средним арифметическим (М) и среднеквадратическим (стандартным) отклонением (m), медианой (Ме), нижним и верхним квартилями [25; 75%]. Для всех критериев использовали общепринятый уровень статистической значимости р=0,05 [15].

Результаты

Обе группы были сравнимы по возрасту: в 1-й группе возраст составил 31,2±0,82 года, Ме=31 [28,0; 35,75] год, а во 2-й группе - 31,1±0,79 [26,5; 35,0] года, Ме=31 год; р=0,81. Рост в группах также статистически не отличался и составил: в 1-й группе 163±0,89 см, Ме=164,0 [160,0; 166,0] см, во 2-й группе - 161,1±1,0 [159,3; 168,0] см, Ме=164,5 см; р=0,57. По массе тела беременные на момент включения в исследование также не отличались: в 1-й группе масса тела составляла 67,0±1,61 [60,0; 73,8] кг, Ме=66,0 кг, во 2-й группе - 63,0±1,82 [55,0; 71,0] кг, Ме=60,0 кг. Рассчитанный ИМТ в обеих группах показал следующие данные: в 1-й группе - 24,6±0,68 [21,6; 26,1] кг/м², Ме=23,9 кг/м², во 2-й группе - 23,5±0,65 кг/м² [20,8; 25,7], Ме=22,3 кг/м²; р=0,051. Таким образом мы видим, что обе группы являются репрезентативными по росту, массе тела и ИМТ.

Также группы не отличались по количеству перво- и повторнобеременных: в 1-й группе их было 72,7 и 27,3%, во 2-й группе - 75,0 и 25,0% соответственно; р=0,91. Не выявлено различий отношении таких параметров, как менструальная функция, использование контрацептивов, в том числе и гормональных, а также частота гинекологической и экстрагенитальной патологии. Однако необходимо отметить, что эндокринопатии статистически значимо чаще встречались в 1-й группе исследования, р=0,007. Нами не выявлено статистических отличий между группами в частоте употребления алкоголя и сигарет.

По итогам наблюдения, по окончанию беременности в 1-й группе всего зарегистрировано 44 (100%) случая ПЭ, во 2-й группе - 15 (34,1%); р<0,001. При этом умеренная ПЭ в 1-й группе развилась у 37 (84,1%) беременных и во 2-й - у 12 (27,3%), р<0,001. Тяжелая ПЭ была зарегистрирована у 7 (15,9%) и у 3 (6,8%) соответственно; р=0,18. В 1-й группе нормальное завершение беременности без развития ПЭ отсутствовало, во 2-й группе таких беременных было 29 (65,9%); р<0,001.

В соответствии с дизайном исследования, нами были изучены морфологические маркеры ПЭ у пациенток 1-й и 2-й групп исследования. Получены следующие результаты: во 2-й группе при анализе препаратов выявлено полнокровие капилляров хориона, в строме ворсин отсутствовали клетки Хофбауэра, на поверхности обнаружено небольшое количество фибриноида Лангханса (рис. 1).

Анализ гистологических препаратов показал: в отдельных полях визуализированы мелкие тромбы в межворсинчатом пространстве (рис. 2).

Также нами были выявлены в некоторых препаратах крупные и многочисленные диапедезные кровоизлияния (см. рис. 2), что, по всей видимости, можно связать с гемодинамическими нарушениями в процессе развития беременности у матери.

В отличие от описанных препаратов, характеризующих неосложненное течение беременности, в 1-й группе у пациенток с рисками развития ПЭ и реализацией в нее выявлен выраженный фибриноидный некроз ворсин хориона, КПО которого достигал 4,17% [3,10; 5,03]. Строма ворсин характеризовалась наличием немногочисленных клеток Хофбауэра (рис. 3).

При анализе полученных срезов плацент после перенесенной ПЭ обращало на себя внимание выраженное полнокровие сосудов плаценты. При этом межворсинчатое пространство в большинстве изученных полей зрения содержало излившуюся кровь и тромботические массы (рис. 4).

Таким образом, проведенный анализ показал, что если в 1-й группе нормальное строение плаценты было у 4 (9,3%) пациенток, то во 2-й - у 11 (25,0%); р=0,053. Отмечалось венозное полнокровие у 32 (74,4%) в 1-й группе и у 24 (54,5%) - во 2-й; р=0,053. При этом не выявлено статистической разницы между обеими группами в частоте умеренного венозного полнокровия сосудов: в 1-й группе оно было у 15 (34,9%) и во 2-й группе - у 14 (31%); выраженное - соответственно у 17 (39,5%); р=0,762 и у 10 (22,7%) пациенток; р=0,147. Частота зафиксированных мелких диапедезных кровоизлияний также не отличалась между группами: в 1-й группе они были выявлены у 8 (18,6%), во 2-й группе - у 7 (15,9%) пациенток; р=0,74.

Выявлено статистически значимое отличие в частоте геморрагического пропитывания плодной части хориона: в 1-й группе оно было у 20 (45,6%) и во 2-й - у 6 (13,6%); р<0,001. Кроме того, выявлено статистически значимое отличие по удельному весу крупных сливающихся очагов фибриноидного некроза; р=0,024.

Анализ ИГХ-исследования показал, что эндотелиальные клетки плацент беременных с ПЭ давали слабую положительную реакцию на PECAM-1. По результатам компьютерной морфометрии установлено, что КПО тромбоцитарно-эндотелиальной молекулы клеточной адгезии в препаратах составил 2,30% [1,51; 3,07]. Напротив, реакция на эндоглин была резко положительной, а его экспрессия составила 6,61% [6,30; 7,04], что показано на рис. 5.

На сегодняшний день рассматривается роль CD31 в адгезии лейкоцитов, тромбоцитов к сосудистому эндотелию. Важно понимать, что адгезия лейкоцитов к эндотелию, опо­средованная PECAM-1, который является трансмембранным гомофильным белком адгезии и экспрессируется в эндотелиальных клетках, приводит к внутриклеточной передаче сигнала, а в дальнейшем способствует диапедезу [16], что, возможно, ведет к формированию нарушений в плацентарной ткани на фоне ПЭ.

Проведенное сравнение с результатами ИГХ-исследования плацент беременных без ПЭ показало, что реакция с антителами к CD31 была положительной в большинстве кровеносных сосудов хориона, в то время как эндоглин присутствовал лишь в отдельных эндотелиальных клетках (рис. 6).

Уровни экспрессии молекулы сосудистой адгезии CD31 (PECAM-1) во 2-й группе составили 7,11% [6,84; 7,50] и эндоглина - 3,17% [2,98; 3,51].

Проведенная компьютерная морфометрия показала, что КПО тромбоцитарно-эндотелиальной молекулы клеточной адгезии во 2-й группе равнялся 7,11% [6,84; 7,50] и статистически значимо превосходил уровни экспрессии в 1-й группе - 2,30% [1,51; 3,07] (статистически значимые отличия между группами, p=0,036). Экспрессия эндоглина в материале от пациенток 1-й группы составила 6,61% [6,30; 7,04] и была статистически значимо выше (в 2,1 раза) аналогичного показателя во 2-й группе - 3,17% [2,98; 3,51], р=0,014.

Проведенный корреляционно-регрессионный анализ продемонстрировал сильную обратную связь между показателями экспрессии CD31 и CD105 (r=-0,69, p=0,032), из чего делаем вывод, что при повышении КПО эндоглина выраженность экспрессии CD31 будет снижаться (см. таблицу). Расчеты проведены в 1-й группе у 43 пациенток, так как у одной участницы из группы произошли экстремально ранние преждевременные роды на фоне тяжелой ПЭ.

Полученные результаты компьютерной морфометрии и проведенный корреляционно-регрессионный анализ соотносятся с данными научной литературы: даже нелетальное повреждение эндотелиальных клеток приводит к снижению экспрессии на ее поверхности PECAM-1 (CD31). Отсюда можно сделать вывод, что низкие величины PECAM-1 в 1-й группе можно рассматривать как проявление эндотелиальной дисфункции [16]. Низкая экспрессия PECAM-1 (CD31) характерна для тяжелого повреждения сосудов с фибриноидным некрозом и тромбозами, что мы наблюдали при исследовании гистологических срезов.

По-видимому, высокая экспрессия CD105 (эндоглин) в образцах с летальным повреждением эндотелия может быть объяснена с позиции ремоделирования сосудов и опосредованного сигнала от трансформирующего фактора роста бета. Из чего можно сделать вывод, что значительное содержание эндоглина в образцах у пациенток 1-й группы можно расценить как своеобразное проявление регенерации эндотелия.

Заключение

Таким образом, исследование плацентарной ткани в сравниваемых группах показало, что при высокой степени риска ПЭ, реализующейся в ее тяжелую или умеренную форму, отмечается статистически значимо более низкий уровень экспрессии тромбоцитарно-эндотелиальной молекулы клеточной адгезии (р=0,036) и высокий уровень экспрессии эндоглина (р=0,014). Возможно, именно более высокий уровень экспрессии тромбоцитарно-эндотелиальной молекулы клеточной адгезии при более низких показателях CD105 (эндоглина) является маркером более раннего "старения" плаценты, характерного для развития ПЭ. Возможно, именно данный механизм дает представление о степени выраженности компенсаторных реакций, нарушение которых ведет к развитию ПЭ. Из проведенного исследования видно, что наблюдение в динамике за сосудами матки и плаценты с параллельным определением общепринятых маркеров ПЭ позволит заблаговременно выделить нарушения в единой биологической системе "мать-плацента-плод" при квалифицированной пренатальной диагностике. Происходящее сосудистое ремоделирование на фоне развития ПЭ ведет к уменьшению просвета сосудов, что негативно влияет как на мать, так и на плод.

Литература

1. Борис Д.А., Шмаков Р.Г. Преэклампсия: современные концепции патогенеза // Акушерство и гинекология. 2022. № 12. С. 12-17. DOI: https://doi.org/10.18565/aig.2022.213

2. Тапильская Н.И., Мельников К.Н., Кузнецова И.А., Глушаков Р.И. Плацентарная недостаточность и синдром задержки роста плода: этиология, профилактика, лечение // Медицинский алфавит. 2020. № 4. С. 6-10. DOI: https://doi.org/10.33667/2078-5631-2020-4-6-10

3. Jinqqi Q., Bingbing W., Xiuying C., Wei W., Xudong Y. Diagnostic biomolecules and combination therapy for pre-eclampsia // Reprod. Biol. Endocrinol. 2022. Vol. 20, N 1. P. 136. DOI: https://doi.org/10.1186/s12958-022-01003-3

4. Hackelöer M., Schmidt L., Verlohren S. New advances in prediction and surveillance of preeclampsia: role of machine learning approaches and remote monitoring // Arch. Gynecol. Obstet. 2023. Vol. 308, N 6. P. 1663-1677. DOI: https://doi.org/10.1007/s00404-022-06864-y

5. Thadhni R., Cerdeira A.S., Karumanchi S.A. Translation of mechanistic advances in preeclampsia to the clinic: long and winding road // FASEB J. 2024. Vol. 38, N 3. Article ID e23441. DOI: https://doi.org/10.1096/fj.202301808R

6. Rana S., Burke S.D., Karumanchi S.A. Imbalances in circulating angiogenic factors in the pathophysiology of preeclampsia and related disorders // Am. J. Obstet. Gynecol. 2022. Vol. 226, N 2S. P. S1019-S1034. DOI: https://doi.org/10.1016/j.ajog.2020.10.022

7. Torres-Torres J., Espino-Y-Sosa S., Martines-Portilla R. et al. A narrative review on the pathophysiology of preeclampsia // Int. J. Mol. Sci. 2024. Vol. 25, N 14. Article ID 7569. DOI: https://doi.org/10.3390/ijms25147569

8. Андреева М.Д., Балаян И.С., Карахалис Л.Ю. Раннее прогнозирование преэклампсии: реальность сегодняшнего дня // Акушерство и гинекология: новости, мнения, обучение. 2023. Т. 11, № 1. С. 19-27. DOI: https://doi.org/10.33029/2303-9698-2023-11-1-19-27

9. Melchiorre K., Giorgione V., Thilaganathan B. The placenta and preeclampsia: villain or victim? // Am. J. Obstet. Gynecol. 2022. Vol. 226, N 2S. P. S954-S962. DOI: https://doi.org/10.1016/j.ajog.2020.10.024 Epub 2021 Mar 24. PMID: 33771361.

10. Bhalla N., Franzén L., Scheynius A., Papadogiannakis N., Hansson S.R., Lager S. et al. Spatial transcriptomics of human placentas reveal distinct RNA patterns associated with morphology and preeclampsia // Placenta. 2023. Vol. 139. P. 213-216. DOI: https://doi.org/10.1016/j.placenta.2023.07.004 Epub 2023 Jul 5. PMID: 37481829.

11. Benton S.J., Leavey K., Grynspan D., Cox B.J., Bainbridge S.A. The clinical heterogeneity of preeclampsia is related to both placental gene expression and placental histopathology // Am. J. Obstet. Gynecol. 2018. Vol. 219, N 6. P. 604.e1-604.e25. DOI: https://doi.org/10.1016/j.ajog.2018.09.036 Epub 2018 Sep 29. PMID: 30278173.

12. Александрович А.С., Пальцева А.И., Алексинский В.С. Особенности морфологии плаценты у беременных с фетоплацентарной недостаточностью // Современные проблемы гигиены, радиационной и экологической медицины. 2019. № 9. C. 3-15.

13. Павлова Н.Г., Беженарь В.Ф., Большакова М.В., Пастушенков В.Л., Яковлева А.А., Карев В.Е. Экспрессия индуцируемого гипоксией фактора-1-альфа (HIF- 1α) в плаценте и ткани мозга плодов при хронической плацентарной недостаточности в условиях эксперимента // Проблемы репродукции. 2022. Т. 28, № 1. C. 36-44. DOI: https://doi.org/10.17116/repro20222801136

14. Wardinger J.E., Ambati S. Placental Insufficiency. StatPearls Publishing, 2021.

15. Халафян А.А. STATISTICA. Математическая статистика с элементами теории вероятностей. М.: БИНОМ, 2010. 410 с.

16. Гончаров Н.В., Попова П.И., Авдонин П.П., Кудрявцев И.В., Серебрякова М.К., Корф Е.А. и др. Маркеры эндотелиальных клеток в норме и при патологии // Биологические мембраны. 2020. Т. 37, № 1. С. 3-21. DOI: https://doi.org/10.31857/S0233475519040054

Материалы данного сайта распространяются на условиях лицензии Creative Commons Attribution 4.0 International License («Атрибуция - Всемирная»)