Особенности плоидного статуса эмбрионов, культивированных с использованием традиционной и time-lapse-технологии (TLT) у женщин оптимального и старшего репродуктивного возраста

• Краснопольская Ксения Владиславовна
• Самойлова Анастасия Александровна
• Ершова Ирина Юрьевна
• Исакова Камила Муслимовна
• Конькова Аглая Львовна
• Бочарова Татьяна Викторовна

Резюме

Цель исследования - изучить влияние традиционной и time-lapse-технологий (TLT) культивирования эмбрионов на их плоидный статус по данным преимплантационного генетического тестирования на анеуплоидии (ПГТ-А) с учетом возраста обследуемых женщин.

Материал и методы. 581 бластоциста, выращенная либо в традиционном СО₂-инкубаторе Binder CB 150 (n=338), либо в time-lapse-инкубаторе EmbryoScope + ES-P1 (n=243), была исследована путем применения ПГТ-А методом секвенирования нового поколения (Next Generation Sequencing, NGS). Из общего числа тестированных бластоцист 88 были получены от женщин в возрасте до 36 лет и 493 - старше 36 лет.

Результаты. При использовании традиционной и TLT клеточного культивирования частота генерации эуплоидных бластоцист достоверно не различалась в когортах эмбрионов, полученных как от женщин младше 36 лет (70,9 против 78,9%, р=0,412), так и старше 36 лет (40,8 против 46,9%, р=0,425). Среди эмбрионов от женщин старше 36 лет в сравнении с эмбрионами от более молодых пациенток отмечалось достоверное снижение (примерно на 20%) доли пригодных к переносу эуплоидных бластоцист при использовании как традиционного культивирования (p=0,004), так и TLT (p<0,001).

Заключение. Использование TLT клеточного культивирования в сравнении с традиционной методологией не обеспечивает снижения частоты эмбриональной анеуплоидии. Представляется оправданным приоритетное назначение ПГТ-А женщинам старшего репродуктивного возраста, поскольку у них отмечается существенное возрастание доли анеуплоидных эмбрионов независимо от особенностей применяемых клеточных инкубаторов.

Ключевые слова: бесплодие; time-lapseтехнология клеточного культивирования; бластоцисты; преимплантационное генетическое тестирование на анеуплоидии

Введение

Известно, что эмбрионы, признаваемые "качественными" по морфологическим критериям, могут иметь отклонения в плоидном статусе, т.е. быть анеуплоидными или с разной степенью мозаицизма, что может быть установлено с помощью преимплантационного генетического тестирования на анеуплоидии (ПГТ-А) [1]. Инцидентность ануеплоидии среди эмбрионов, полученных в неселективной популяции от женщин младше 35 лет, составляет примерно 30%, причем в последующем доля эмбрионов с нарушениями плоидности продолжает прогрессивно нарастать и может достигать 80% и более у пациенток старше 42 лет [2]. Полагают, что имеющие место хромосомные аномалии не только снижают вероятность успешной имплантации, уменьшая показатель частоты наступления беременности (ЧНБ) на перенос эмбрионов, но и становятся причиной 30-50% случаев ранних репродуктивных потерь [3]. Применение для ПГТ-А современных диагностических платформ, таких как секвенирование нового поколения (Next Generation Sequencing, NGS), позволяет достаточно надежно выбраковывать анеуплоидные эмбрионы, что служит улучшению терапевтических исходов вспомогательных репродуктивных технологий. Очевидно, что стратегия, направленная на идентификацию анеуплоидных эмбрионов с последующей отменой их переноса, снижает как риск неэффективной имплантации, так и общую частоту репродуктивных потерь в случаях зачатия при использовании эмбрионов ненадлежащего качества. Важно, что такой подход освобождает от необходимости выполнения терапевтических мероприятий в безнадежных случаях и предупреждает совершенно неоправданные психические нагрузки, связанные с бесплодным ожиданием успеха проводимого лечения.

Предполагается, что в сравнении с традиционной методологией культивирования эмбрионов использование клеточных инкубаторов, в которых применяется time-lapse-технология (TLT) непрерывной видеорегистрации эмбриогенеза, позволит более успешно решать задачу отбора подходящих для переноса эмбрионов. Очевидно, что этому способствует добавление к рутинно используемым морфологическим критериям еще и дополнительных морфокинетических характеристик, получаемых в режиме реального времени. Однако пока остается неясным, может ли TLT клеточного культивирования обеспечивать уменьшение частоты анеуплоидии среди отбираемых для переноса эмбрионов, что предопределяет актуальность выполнения соответствующего исследования.

Цель исследования - изучить влияние традиционной и TLT культивирования эмбрионов на их плоидный статус по данным ПГТ-А с учетом возраста обследуемых женщин.

Материал и методы

С учетом поставленной в работе цели объектом исследования были бластоцисты (n=581), выращенные из зигот с применением традиционной или TLT клеточного культивирования и подвергнутые оценке плоидного статуса с применением ПГТ-А для определения пригодности для переноса/криоконсервации. Распределение бластоцист, прошедших преимплантационное генетическое тестирование, с учетом возраста женщин, от которых они были получены (до или старше 36 лет), а также от типа использованного клеточного инкубатора, представлено в табл. 1.

Перед включением в протокол экстракорпорального оплодотворения (ЭКО) + ПГТ-А все женщины, от которых были получены эмбрионы для настоящего исследования, прошли обследование в соответствии с рекомендациями, изложенными в приказе Минздрава России от 2020 г. № 803 "О порядке использования вспомогательных репродуктивных технологий (ВРТ), противопоказаниях и показаниях к их применению". Для стимуляции суперовуляции у этих пациенток использовали различные препараты гонадотропинов в рамках либо стандартного длинного протокола с агонистом гонадотропин-рилизинг-гормона (ГнРГ), либо короткого протокола с антагонистом ГнРГ. Агонисты ГнРГ назначали с 19-21-го дня предыдущего (предшествующего лечебному) цикла, антагонисты ГнРГ - со дня достижения лидирующим фолликулом 14 мм в диаметре при гонадотропиновой стимуляции. Через 35-36 ч после введения триггера овуляции выполнялась пункция яичников c забором всех яйцеклеток диаметром >14 мм. Оплодотворение зрелых ооцитов проводили через 39-41 ч после введения триггера методом интрацитоплазматической инъекции сперматозоида в ооцит (ИКСИ). Через 16-18 ч после ИКСИ проводили оценку оплодотворения.

Период культивирования зигот составлял 5-6 сут. Для этой цели были использованы:

· традиционный инкубатор Binder CB 150 производства Binder GmbH, предусматривающий контактную (с извлечением эмбрионов из рабочей камеры) дискретную (1 раз в сутки) визуальную оценку эмбриогенеза;

· инкубатор EmbrioSkope + ES-P1 производства Vitrolife, в котором используется TLT бесконтактного непрерывного фотодокументирования развития эмбрионов.

Иссечение блестящей оболочки эмбрионов проводили на 4-е сутки культивирования при помощи лазерной системы OCTAX NaviLase производства Vitrolife. Оценку качества сформировавшихся бластоцист осуществляли на 5-6-й день развития эмбрионов с использованием морфологических критериев Д. Гарднера [4]. Хорошее качество констатировали у бластоцист с параметрами на уровне 2ВВ-6АА. Именно такие бластоцисты отбирали для последующего выполнения биопсии клеток трофэктодермы и проведения ПГТ-А. При биопсии отделяли 4-10 клеток трофэктодермы. Биоптат переносили в индивидуальные пробирки типа эппендорф, содержащие 2,5 мл лизирующего буфера. Пробирки замораживали и передавали в генетическую лабораторию для проведения преимплантационного генетического тестирования методом секвенирования нового поколения (NGS).

При оценке результатов ПГТ-А в соответствии с рекомендациями PGDIS [1] к эуплоидным (пригодным для переноса/криоконсервации) эмбрионам относили:

· не имеющие аномальных клеток в тестируемых биоптатах;

· cо степенью мозаицизма среди анализируемых клеток трофэктодермы не более 20%.

Эмбрионы со степенью мозаицизма в клеточном составе трофэктодермы более 20% классифицировали как анеуплоидные и соответственно не рекомендовали к практическому использованию.

Полученные результаты обрабатывали с помощью методов вариационной статистики, применяя компьютерную программу SPSS Statistics 22 (США). При парных сравнениях частот анализируемых показателей выявленные различия считали достоверными при уровне значимости р<0,05.

Результаты

В общей когорте обследованных пациенток культивирование полученных от них эмбрионов с использованием традиционного и TLT-инкубаторов (табл. 2) обеспечивало сопоставимую частоту получения бластоцист с эуплоидным статусом по данным ПГТ-А, т.е. эмбрионов, пригодных к переносу (53,3 и 50,2%, р=0,468).

Анализ этих же данных с учетом возраста взятых под наблюдение пациенток позволил установить, что у женщин младше 36 лет доля полученных бластоцист с эуплоидным статусом оказалась значительно выше в сравнении с аналогичным показателем, рассчитанным у пациенток старшего репродуктивного возраста (см. рисунок). Эта закономерность статистически значимо проявляла себя как при традиционном культивировании эмбрионов в группе А (70,9 против 49,8%, р=0,004), так и при применении для их выращивания TLT в группе Б (78,8 против 46,9%, р<0,001).

При оценке в одних и тех же возрастных группах частоты полученных пригодных для переноса эмбрионов с учетом типа использованного инкубатора было установлено, что сопоставлявшиеся технологии культивирования генетического материала обеспечивали практически одинаковые результаты. Так, при применении традиционной и TLT выращивания эмбрионов в возрастной группе младше 36 лет доля эуплодидных бластоцист составила соответственно 70,9 и 78,9%, р=0,412, а у женщин более старшего возраста - соответственно 49,8 и 46,9%, р=0,425.

Обсуждение

По современным представлениям, терапевтический успех ЭКО во многом зависит от так называемого эмбрионального фактора, определяемого качеством подготавливаемых к переносу эмбрионов [5]. При использовании традиционных СО₂-инкубаторов о кондиции культивируемых эмбрионов судят по морфологические критериям, которые определяются дискретно, т.е. в отдельные моменты времени на протяжении заданного периода инкубирования. Такие критерии в разные периоды эмбриогенеза включают в себя морфологию пронуклеусов и ядрышек, количество, размер и форму образующихся бластомеров, фрагментацию, мультинуклеацию, экспандирование бластоцисты, внутреннюю клеточную массу и внешний вид трофэктодермы. По завершению этапа культивирования эмбрионов до стадии бластоцисты предусматривается окончательная оценка морфологических характеристик, по совокупности которых на основе критериев Д. Гарднера [4] делается заключение о пригодности исследуемой бластоцисты к переносу/криоконсервации. Применяемые гарднеровские критерии предусматривают учет степени развития бластоцисты, статус хетчинга (данные характеристики отображаются цифрами от 1 до 6), а также оценку внутренней клеточной массы и трофэктодермы (представляемую буквами А, В, С для каждого из указанных параметров). При нормальном развитии эмбрионов на 5-6-й день культивирования около половины эмбрионов достигает стадии бластоцисты. При этом пригодными для переноса/криоконсервации считаются бластоцисты с оценкой на уровне 2ВВ-6АА.

Внедрение в клиническую практику time-lapse-технологии (TLT) предоставило возможность добавить к традиционным дискретным критериям оценки качества эмбрионов большой массив морфокинетических показателей [6-8]. Такие показатели определяются при круглосуточном наблюдении за эмбрионами в режиме реального времени. Непрерывное наблюдение позволяет получать информацию, которая может быть упущена при традиционной дискретной оценке, в частности аномальные клеточные деления, такие как прямое и обратное дробление бластомеров [9], беспорядочное движение пронуклеусов и замедленное исчезновение ядерных оболочек [10], отклонения в сроках начала кавитации [11]. Полагают, что неполучение такого рода информации при дискретном отслеживании параметров эмбрионального развития в традиционных инкубаторах может приводить к просчетам в ранжировании эмбрионов по качеству, что аргументирует приоритетность использования для той же цели time-lapse-технологии [12-14]. При этом очевидным преимуществом TLT-инкубаторов перед традиционными аналогами является их большее удобство в применении, поскольку эмбриологам не приходится выполнять манипуляции, связанные с дежурным извлечением и оценкой качества развивающихся эмбрионов [15, 16].

Заслуживает внимания, что получаемые в разных плоскостях с помощью цифровой камеры изображения развивающихся эмбрионов собираются через равные короткие промежутки времени и трансформируются в видеоотчет, который обеспечивает возможность документировать происходящие события. Это позволяет проводить углубленный анализ таких видеоотчетов в любое время с привлечением при необходимости дополнительных экспертов, что служит повышению качества эмбриологической диагностики в результате коллегиальных заключений. Архивирование собранной видеоинформации также предоставляет возможность для обучения (повышения квалификации) специалистов-эмбриологов и стандартизации морфокинетических оценок на основе обмена базами данных между эмбриологическими лабораториями [17, 18]. Тем не менее следует признать, что при непрерывной видеорегистрации эмбриогенеза интерпретация патологической значимости обнаруживаемых изменений часто остается непростой задачей, поскольку нет единых (подтверждаемых всеми специалистами) морфокинетических маркеров дефектов качества эмбрионов [19, 20]. Очевидно, что сложившаяся ситуация диктует целесообразность продолжения проведения исследований, направленных на идентификацию критически важных для оценки эмбриогенеза морфокинетических критериев и создание на их основе более надежных прогностических моделей.

Анализируя достоинства time-lapse-технологии клеточного культивирования, отдельные специалисты акцентируют внимание на том, что исключение стресса для развивающихся эмбрионов, связанного с их извлечением из рабочей камеры инкубатора, может служить улучшению условий для эмбриогенеза [21, 22]. Полагают, что это достигается за счет предупреждения изменений в характере внешних воздействий на метаболизм делящихся клеток и в конечном итоге способствует улучшению морфологических характеристик культивируемых эмбрионов. Однако до выполнения данного исследования представлялось неясным, может ли TLT клеточного культивирования за счет того же эффекта (т.е. путем предупреждения метаболического стресса, связанного с извлечением эмбрионов из рабочей камеры инкубатора) обеспечивать уменьшение частоты анеуплоидии среди отбираемых для переноса бластоцист.

Полученные при применении ПГТ-А собственные результаты позволили установить, что поздний репродуктивный возраст (старше 36 лет) ассоциируется с заметным уменьшением доли пригодных для переноса бластоцист из-за выбраковки анеуплоидных эмбрионов, доля которых возрастала почти двукратно. Данная закономерность проявляла себя в одинаковой степени при использовании как традиционной, так и TLT клеточного культивирования. Проведенное одновременно сопоставление результатов в одних и тех же возрастных группах (у женщин в возрасте до и старше 36 лет) не подтвердило статистически значимого различия между когортами, в которых использовали традиционную и TLT клеточного культивирования по критерию частоты получения пригодных для переноса эуплоидных эмбрионов.

Собранный фактический материал позволяет сформулировать два положения.

Во-первых, TLT клеточного культивирования явно не обеспечивает противодействия возрастному фактору, который у женщин старше 36 лет обусловливает резкое возрастание частоты анеуплоидных эмбрионов, и соответственно сокращает долю пригодных для переноса/криоконсервации бластоцист. Данная закономерность весьма наглядно подтверждается фактом одинакового снижения доли эуплоидных эмбрионов у женщин старшего репродуктивного возраста в сравнении с более молодыми пациентками при использовании как традиционной, так и TLT клеточного культивирования.

Во-вторых, в одних и тех же возрастных группах применение TLT вместо традиционного способа выращивания эмбрионов не сопровождается сколько-нибудь заметным выигрышем по критерию увеличения частоты получаемых эуплоидных эмбрионов. Данное наблюдение указывает на то, что частота эмбриональной анеуплоидии в любой возрастной группе вообще не зависит от наличия или отсутствия метаболического стресса, связанного с извлечением культивируемых эмбрионов из рабочей камеры инкубатора. Это означает, что особенности культивирования эмбрионов, определяемые типами клеточных инкубаторов (с использованием или без использования TLT) никак не отражаются на плоидном статусе выращиваемых эмбрионов.

Полученные результаты позволяют утверждать, что ПГТ-А полезно выполнять независимо от технических особенностей применяемых инкубаторов, т.е. оснащенных или нет бесконтактной системой непрерывной видеорегистрации эмбриогенеза. Данная рекомендация является особенно актуальной для женщин позднего репродуктивного возраста, у которых отмечается существенное возрастание доли анеуплоидных эмбрионов при любом из способов их культивирования, сравниваемых в настоящей работе.

Заключение

Выполненное нами исследование приводит к заключению, что целесообразность назначения ПГТ-А не должна определяться техническими особенностями применяемых инкубаторов, поскольку при использовании традиционной и TLT клеточного культивирования частота анеуплоидных эмбрионов оказывается фактически одинаковой. С учетом того что у женщин старшего репродуктивного возраста отмечается драматическое сокращение количества пригодных к переносу эмбрионов из-за прогрессирования частоты эмбриональной анеуплоидии, представляется оправданным приоритетное назначение ПГТ-А именно этому контингенту больных бесплодием, причем независимо от типа использованного клеточного инкубатора.

ЛИТЕРАТУРА

1. Gleicher N., Albertini D.F., Barad D.H., Homer H., Modi D., Murtinger M. et al.; International Do Not Harm Group in IVF (IDNHG-IVF). The 2019 PGDIS position statement on transfer of mosaic embryos within a context of new information on PGT-A // Reprod. Biol. Endocrinol. 2020. Vol. 18, N 1. P. 57. DOI: https://doi.org/10.1186/s12958-020-00616-w

2. Webster A., Schuh M. Mechanism of aneuploidy in human eggs // Trends Cell Biol. 2017. Vol. 27, N 1. P. 55-68. DOI: https://doi.org/10.1016/j.tcb.2016.09.002

3. McKinlay Gardner R.J., Amor D.J. Gardner and Sutherland’s chromosome abnormalities and genetic counseling // Oxford Monographs on Medical Genetics. 5th ed. Oxford University Press, 2018. DOI: https://doi.org/10.1093/med/9780199329007.001.0001

4. Gardner D., Schoolcraft W., Wagley L., Schlenker T., Stevens J., Hesla J. A prospective randomized trial of blastocyst culture and transfer in IVF // Hum. Reprod. 1998. Vol. 13, N 12. P. 3434-3440. DOI: https://doi.org/10.1093/humrep/13.12.3434

5. Hollands P. The Fertility Promise: the Facts Behind in vitro Fertilisation (IVF). Bentham Science Publishers, 2021. DOI: https://doi.org/10.2174/9789815040289121010013

6. Aparicio-Ruiz B., Romany L., Meseguer M. Selection of preimplantation embryos using time-lapse microscopy in in vitro fertilization: state of the technology and future directions // Birth Defects Res. 2018. Vol. 110, N 8. P. 648-653. DOI: https://doi.org/10.1002/bdr2.1226

7. ESHRE Working Group on Time-Lapse Technology; Apter S., Ebner T., Freour T., Guns Y., Kovacic B., Le Clef N. et al. Good practice recommendations for the use of time-lapse technology // Hum. Reprod. Open. 2020. Vol. 2020, N 2. Article ID hoaa008 DOI: https://doi.org/10.1093/hropen/hoaa008

8. Yang Q., Zhu L., Wang M., Huang B., Li Z., Hu J. et al. Analysis of maturation dynamics and developmental competence of in vitro matured oocytes under time-lapse monitoring // Reprod. Biol. Endocrinol. 2021. Vol. 19. P. 183. DOI: https://doi.org/10.1186/s12958-021-00868-0

9. Jin L., Dong X., Tan W., Huang B. Incidence, dynamics and recurrences of reverse cleavage in aneuploid, mosaic and euploid blastocysts, and its relationship with embryo quality // J. Ovarian Res. 2022. Vol. 15, N 1. P. 91. DOI: https://doi.org/10.1186/s13048-022-01026-9

10. Athayde Wirka K., Chen A.A., Conaghan J., Ivani K., Gvakharia M., Behr B. et al. Atypical embryo phenotypes identified by time-lapse microscopy: high prevalence and association with embryo development // Fertil. Steril. 2014. Vol. 101, N 6. P. 1637-1648.e1-e5. DOI: https://doi.org/10.1016/j.fertnstert.2014.02.050

11. Soukhov E., Karavani G., Szaingurten-Solodkin I., Alfayumi-Zeadna S., Elharar G., Richter D. et al. Prediction of embryo implantation rate using a sole parameter of timing of starting blastulation // Zigote. 2022. Vol. 30, N 4. P. 501-508. DOI: https://doi.org/10.1017/S0967199421000952

12. Ahlström A., Lundin K., Lind A.-K., Gunnarsson K., Westlander G., Park H. et al. A double-blind randomized controlled trial investigating a time-lapse algorithm for selecting Day 5 blastocysts for transfer // Hum. Reprod. 2022. Vol. 37, N 4. P. 708-717. DOI: https://doi.org/10.1093/humrep/deac020

13. Reignier A., Lefebvre T., Loubersac S., Lammers J., Barriere P., Freour T. Time-lapse technology improves total cumulative live birth rate and shortens time to live birth as compared to conventional incubation system in couples undergoing ICSI // J. Assist. Reprod. Genet. 2021. Vol. 38, N 4. P. 917-923. DOI: https://doi.org/10.1007/s10815-021-02099-z

14. Storr A., Venetis C.A., Cooke S., Susetio D., Kilani S., Ledger W. Morphokinetic parameters using time-lapse technology and day 5 embryo quality: a prospective cohort study // J. Assist. Reprod. Genet. 2015. Vol. 32, N 7. P. 1151-1160. DOI: https://doi.org/10.1007/s10815-015-0534-y

15. Racowsky C., Kovacs P., Martins W.P. A critical appraisal of time-lapse imaging for embryo selection: where are we and where do we need to go? // J. Assist. Reprod. Genet. 2015. Vol. 32, N 7. P. 1025-1030. DOI: https://doi.org/10.1007/s10815-015-0510-6

16. Boueilh T., Reignier A., Barriere P., Freour T. Time-lapse imaging systems in IVF laboratories: a French national survey // J. Assist. Reprod. Genet. 2018. Vol. 35, N 12. P. 2181-2186. DOI: https://doi.org/10.1007/s10815-018-1302-6

17. Ciray H.N., Campbell A., Agerholm I.E., Aguilar J., Chamayou S., Esbert M. et al.; Time-Lapse User Group. Proposed guidelines on the nomenclature and annotation of dynamic human embryo monitoring by a time-lapse user group // Hum. Reprod. 2014. Vol. 29, N 12. P. 2650-2660. DOI: https://doi.org/10.1093/humper/deu278

18. Rubio I., Galan A., Larreategui Z., Ayerdi F., Bellver J., Herrero J. et al. Clinical validation of embryo culture and selection by morphokinetic analysis: a randomized, controlled trial of the EmbryoScope // Fertil. Steril. 2014. Vol. 102, N 5. P. 1287-1294.e5. DOI: https://doi.org/10.1016/j.fertnstert.2014.07.738

19. Lundin K., Ahlstrome A. Quality control and standardization of embryo morphology scoring and viability markers // Reprod. Biomed. Online. 2015. Vol. 31, N 4. P. 459-471. DOI: https://doi.org/10.1016/j.rbmo.2015.06.026

20. Адамян Л.В., Пивазян Л.Г., Крылова Е.И., Обосян Л.Б., Саркисова А.И., Никифорова П.О. Применение технологии time-lapse в процессе культивирования. Оценки и отбора эмбрионов при проведении процедур экстракорпорального оплодотворения и интрацитоплазматической инъекции сперматозоида: систематический обзор // Проблемы репродукции. 2023. Т. 29, № 2. С. 14-22. DOI: https://doi.org/10.17116/repro29232902114

21. Meseguer M., Hilligsoe K.M., Pedersen K.S., Herrero J., Tejera A., Garrido N. Pregnancy rates after incubation in new time-lapse incubator (embryoscope) providing detailed information about embryo development compared to incubation in a standard incubator // Fertil. Steril. 2010. Vol. 94, N 4. P. S150. DOI: https://doi.org/10.1016/j.fertnstert.2010.07.603

22. Cruz M., Gadea B., Garrido N., Pedersen K.S., Martínez M., Pérez-Cano I. et al. Embryo quality, blastocyst and ongoing pregnancy rates in oocyte donation patients whose embryos were monitored by time-lapse imaging // J. Assist. Reprod. Genet. 2011. Vol. 28, N 7. P. 569-573. DOI: https://doi.org/10.1007/s10815-011-9549-1

Материалы данного сайта распространяются на условиях лицензии Creative Commons Attribution 4.0 International License («Атрибуция - Всемирная»)