Роль микроРНК в патогенезе рецидивирующих лейомиом матки

• Карамян Ромелла Артуровна
• Ордиянц Ирина Михайловна
• Веряскина Юлия Андреевна
• Арютин Дмитрий Геннадьевич
• Рыженков Константин Валерьевич

Резюме

Цель исследования - определить эпигенетические детерминанты рецидивирующей лейомиомы матки (ЛМ) в репродуктивном возрасте.

Материал и методы. В исследовании приняли участие 66 пациенток, которые были разделены на 2 группы: в I вошли 42 пациентки, перенесшие миомэктомию, из них 18 (42,9%) с рецидивом в анамнезе, во II - 24 после экстирпации матки, из них 4 (16,7%) с рецидивом в анамнезе. Пациентки проходили лечение и наблюдение в гинекологическом отделении ГБУЗ ГКБ № 29 им. Н.Э. Баумана ДЗМ. Из операционного материала вырезали участок ткани размерами 5×5 см (из миоматозных узлов и миометрия в случае экстирпации матки). Вырезанная ткань была заморожена при температуре -25 °С. Исследовалась экспрессия 21 микроРНК: let7, 20a, 23b, 29b, 146b, 92a-1-5, 93, 100-3p, 10b, 223, 182, 146b, 21, 200a, 30a, 156a, 122, 10a, 15a, 16, 26a. Измерение уровней экспрессии микроРНК методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) в реальном времени проводили на амплификаторе CFX96 (Bio-Rad Laboratories, США). Для анализа полученных данных пороговых циклов ПЦР в реальном времени использовали метод 2(-∆Ct) (Livak, Schmittgen, 2001).

Статистическую обработку полученных данных проводили на основе непараметрического коэффициента Манна-Уитни с использованием программного обеспечения STATISTICA 12.0 (StatSoft Inc., США). При значении p<0,05 разницу считали статистически достоверной.

Дизайн. Проведено проспективное нерандомизированное продольное исследование.

Результаты. Группы были сопоставимы по возрасту менархе и начала половой жизни, частоте перенесенных и сопутствующих экстрагенитальных и гинекологических заболеваний. Миомэктомия проводилась пациенткам более молодого возраста [39,6 (37,9-41,2) года] в сравнении с группой с экстирпацией матки [46,8 (46,0-47,5) года] со статистически значимой разницей p=0,001. При изучении паритета пациенток в I и II группах также были выявлены статистически значимые различия (p=0,021). В репродуктивном возрасте пациенткам с бесплодием достоверно чаще выполнялась миомэктомия в сравнении с пациентками, у которых в анамнезе были самопроизвольные роды (p=0,032). При сравнении длительности заболевания в зависимости от объема оперативного лечения статистически значимых различий выявлено не было. Вместе с тем миомэктомия была выполнена каждой 4-й пациентке с размером матки до 10 нед (38,1%), каждой 2-й с размером матки от 11 до 15 нед (50,0%) и 11,9% - более 15 нед, а в группе пациенток, прооперированных в объеме экстирпации матки, - 4,2; 66,7 и 29,2% соответственно, p=0,006. При сравнении размеров матки в зависимости от объема оперативного лечения были получены статистически значимые различия (p=0,005).

Рецидив заболевания в течение 1-3 лет был зарегистрирован у каждой 2-й пациентки, перенесшей миомэктомию [n=18 (42,9%)], и у каждой 6-й, перенесшей экстирпацию матки [n=4 (16,7%)]. При анализе паритета пациенток с рецидивирующей ЛМ и без рецидива были получены статистически значимые различия (p=0,012). Установлено, что у пациенток без родов в анамнезе выше вероятность выявления рецидивирущей ЛМ в сравнении с пациентками с самопроизвольными родами в анамнезе (p=0,023). Между сопоставляемыми признаками отмечалась относительно сильная связь (V Крамера = 0,360). Установлены статистически значимые различия и в длительности заболевания у сравниваемых групп (с рецидивом и без рецидива, p=0,023).

При сравнении уровня экспрессии микроРНК в миоматозных узлах в зависимости от объема оперативного лечения (миомэктомия или экстирпация матки) не выявлено статистически значимых различий. Вместе с тем при сравнении экспрессии микроРНК в миоматозных узлах и миометрии в материале после экстирпации матки получены статистически значимые различия для следующих 8 микроРНК из 20: let7, 20a, 26a, 29b, 100, 10b, 21, 10a. Экспрессия микроРНК: Let7, 20a, 100, 10a была в 1,5 раза ниже в миоматозном узле по сравнению с аналогичными показателями в миометрии, а микроРНК-26а, микроРНК-29b, микроРНК-10b - в 2 раза. Что касается микроРНК-21, то экспрессия данной микроРНК была в 1,6 раза выше в миоматозном узле по сравнению с аналогичным показателем в миометрии.

Заключение. Выявленные различия в экспрессии 8 микроРНК из 20 изученных (let7, 20a, 26a, 29b, 100, 10b, 21, 10a-5) доказывают, что эти нуклеотидные последовательности играют ключевую роль в формировании ЛМ. Это дает стимул для дальнейшего углубленного исследования в данной области. Авторы не выявили связь между уровнем экспрессией микроРНК в миоматозных узлах в зависимости от объема оперативного лечения (миомэктомия или экстирпация матки) и в группах сравнения в зависимости от рецидива

в анамнезе. Напротив, выявлено снижение уровня экспрессии Mir Let7, Mir 20a, Mir 100, Mir 10a-5p в 1,5 раза в миоматозном узле по сравнению с аналогичными показателями в миометрии, а микроРНК-26а, микроРНК-29b, микроРНК-10b - в 2 раза. Что касается микроРНК-21, экспрессия данной микроРНК была в 1,6 раза выше в миоматозном узле по сравнению с показателем в миометрии.

Ключевые слова:лейомиома; рецидивирующая миома матки; микроРНК

Введение

Лейомиома матки (ЛМ) - самое частое заболевание в гинекологии, представляющее важную социально значимую проблему для здравоохранения. Беспокойство вызывают не только симптомы ЛМ, такие как аномальное маточное кровотечение, сдавление смежных органов, частое мочеиспускание или обстипация, но и осложнения, вызванные ЛМ: хроническая анемия, бесплодие и, хоть и редкая, но вероятность малигнизации. Существует много вариантов лечения: от наблюдения и медикаментозной терапии, малоинвазивных методов [фокусированный ультразвук (ФУЗ-абляция), эмболизация маточных артерий] до хирургического лечения - миом- и гистерэктомии.

Молекулярные механизмы, которые приводят к трансформации нормальных миоцитов в клетки ЛМ, активно изучаются. Множество исследований генома в клетках ЛМ привело к открытию новых биологических сигнальных путей, включая влияние микроРНК (миРНК) на регуляцию внутриклеточных процессов, c чем и связан увеличенный спрос на идентификацию миРНК. В большинстве своем миРНК воздействуют на процессы миграции, апоптоза, трансформации, инвазии. Известно, что важную роль в этом процессе играют стрессовое воздействие, гипоксия, сокращения матки. Ткань ЛМ плохо кровоснабжается, содержит пучки гладкомышечных клеток (ГМК) и внеклеточного матрикса (ВКМ), состоящего из коллагена, фибронектина, ламинина и протеогликанов. Механотрансдукция - это процесс, при котором механическое воздействие превращается в биохимический сигнал, благодаря которому клетки адаптируются к изменяющимся окружающим условиям. Структурные и функциональные изменения в ВКМ приводят к росту ЛМ, что открывает новые горизонты для поиска терапевтических мишеней.

Несмотря на множество исследований, патогенез остается не до конца изученным, что не позволяет найти терапевтические мишени для разработки этиотропного лечения. Все методы лечения на сегодняшний день остаются малоэффективными и являются лишь симптоматическими.

Материал и методы

В исследовании приняли участие 66 пациенток с медианой возраста 43 года, размером матки 13 нед, с избыточной массой тела [с индексом массы тела (ИМТ) 25,6 кг/м²], поступившие на оперативное лечение. Показаниями к оперативному лечению считались: длительные обильные менструации, приводящие к анемии; большие размеры миоматозных узлов и матки; болевой синдром; рецидивирующие аномальные маточные кровотечения; синдром сдавления смежных органов.

66 прооперированных авторами пациенток были разделены на 2 группы: I группу составили 42 пациентки, перенесшие миомэктомию, из них 18 (42,9%) с рецидивом в анамнезе, II группу - 24 пациентки, перенесшие экстирпацию матки, из них 4 (16,7%) с рецидивом в анамнезе. Пациентки проходили лечение и наблюдение в отделении гинекологии ГБУЗ ГКБ № 29 им. Н.Э. Баумана ДЗМ. Из операционного материала вырезали участок ткани размерами 5×5 см (из миоматозных узлов и миометрия в случае экстирпации матки). Вырезанная ткань была заморожена при температуре -25 °С. Исследовалась экспрессия 21 миРНК: let7, 20a, 23b, 29b, 146b, 92a-1-5, 93, 100, 10b, 223, 182, 146b, 21, 200a, 30a, 156a, 122, 10a, 15a, 16, 26a.

Полимеразная цепная реакция в реальном времени

Измерение уровней экспрессии миРНК методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) в реальном времени проводили на амплификаторе CFX96 (Bio-Rad Laboratories, США). Реакцию проводили в объеме 30 мкл: 3 мкл полученной комплементарной ДНК (кДНК), 14 мкл H₂O, 3 мкл 10-кратного буфера для ПЦР (АО "Вектор-Бест", Россия), 3 мкл 4 мМ раствора дезоксинуклеозидтрифосфатов, 3 мкл 10% раствора бычьего сывороточного альбумина (BSA), 1 мкл Taq-полимеразы (АО "Вектор-Бест", Россия) в комплексе с моноклональными антителами к ее активному центру (Clontech, США), 3 мкл раствора прямого, 5 мкМ обратного праймера и 2,5 мкМ зонда. Системы праймеров и зондов разработаны АО "Вектор-Бест", эффективность реакции составляла 90-100%. Анализ полученных данных пороговых циклов ПЦР в реальном времени проводили методом 2(-∆Ct) (Livak, Schmittgen, 2001).

Обработка данных

Статистическую обработку полученных данных проводили на основе непараметрического коэффициента Манна-Уитни с использованием программного обеспечения STATISTICA 12.0 (StatSoft Inc., США). При значении p<0,05 разницу считали статистически достоверной.

Результаты

Группы были сопоставимы по возрасту менархе и началу половой жизни, частоте перенесенных и сопутствующих экстрагенитальных и гинекологических заболеваний. Миомэктомию выполняли у пациенток более молодого возраста [39,6 (37,9-41,2) лет] в сравнении с группой пациенток с экстирпацией [46,8 (46,0-47,5) года] со статистически значимой разницей p=0,001. При изучении паритета пациенток в I и II группах также выявлены статистически значимые различия (p=0,021). В репродуктивном возрасте пациенткам с бесплодием достоверно чаще выполняли миомэктомию в сравнении с пациентками, у которых в анамнезе были самопроизвольные роды (p=0,032). При сравнении длительности заболевания в зависимости от объема оперативного лечения статистически значимых различий выявлено не было.

Вместе с тем миомэктомия была проведена каждой 4-й пациентке с размером матки до 10 нед (38,1%), каждой 2-й - от 11 до 15 нед (50,0%) и 11,9% - >15 нед, а в группе пациенток, прооперированных в объеме экстирпации матки - у 4,2; 66,7 и 29,2% соответственно. При сравнении размеров матки в зависимости от объема оперативного лечения были получены статистически значимые различия (p=0,005). Выявленные различия были обусловлены большими размерами матки у пациенток, перенесших ее экстирпацию, в сравнении с группой пациенток с миомэктомией (p=0,006).

Рецидив заболевания в течение 1-3 лет был зарегистрирован у каждой 2-й пациентки, перенесшей миомэктомию [n=18 (42,9%)], и у каждой 6-й - экстирпацию матки [n=4 (16,7%)]. При анализе паритета пациенток с рецидивирующей ЛМ и без рецидива получены статистически значимые различия (p=0,012). Установлено, что у пациенток без родов в анамнезе выше вероятность рецидивирущей ЛМ в сравнении с пациентками с самопроизвольными родами в анамнезе (p=0,023). Между сопоставляемыми признаками отмечалась относительно сильная связь (V Крамера = 0,360). Установлены статистически значимые различия и в длительности заболевания у сравниваемых групп (с рецидивом и без рецидива, p=0,023).

Относительный уровень экспрессии миРНК-Let7 в миоматозном узле составил 1,02 (0,63-1,42), а в миометрии - 1,33 (0,80-1,52); это указывает на то, что в миоматозном узле был более низкий уровень, чем в миометрии, со статистически значимой разницей (p=0,037). Аналогичным образом относительный уровень экспрессии миРНК-20а в миоматозном узле составлял 1,30 (0,90-1,84), а в миометрии - 1,70 (1,20-2,51); это показывает, что в миоматозном узле имел место явно более низкий уровень, чем в миометрии, со статистически значимой разницей (p=0,057). Относительный уровень экспрессии миРНК-100 в миоматозном узле составил 1,10(0,80-1,93), а в миометрии - 1,60 (1,30-1,93); это позволяет предположить, что в миоматозном узле уровень был немного ниже, чем в миометрии, со статистически значимой разницей (p=0,011) (рис. 1).

Аналогичным образом относительный уровень экспрессии миРНК-10b в миоматозном узле составлял 2,90 (1,60-5,04), а в миометрии - 4,80 (3,20-5,61): это показывает, что в миоматозном узле имел место явно более низкий уровень, чем в миометрии, со статистически значимой разницей (p=0,032). Относительный уровень экспрессии миРНК-10а в миоматозном узле составил 0,40 (0,20-0,83), а в миометрии - 1,01 (0,70-1,63); это позволяет предположить, что в миоматозном узле уровень был немного ниже, чем в миометрии, со статистически значимой разницей (p=0,001). Относительный уровень экспрессии миРНК-29b в миоматозном узле составил 2,10 (1,20-3,73), а в миометрии - 4,81 (3,80-5,83); это позволяет предположить, что в миоматозном узле уровень был немного ниже, чем в миометрии, со статистически значимой разницей (p=0,001) (рис. 2).

Вместе с тем относительный уровень экспрессии миРНК-21-5р в миоматозном узле составил 19,11 (12,53-28,74), а в миометрии - 11,91 (9,20-19,61); это указывает на то, что в миоматозном узле имел место явно более высокий уровень, чем в миометрии, со статистически значимой разницей (p=0,012).

При сравнении уровня экспрессии миРНК в миоматозных узлах в зависимости от объема оперативного лечения (миомэктомия или экстирпация матки) не было выявлено статистически значимых различий. Вместе с тем при сравнении экспрессии микроРНК в миоматозных узлах и миометрии в материале после экстирпации матки были получены статистически значимые различия для следующих 8 миРНК из 20: let7, 20a, 26a, 29b, 100, 10b, 21, 10a. Из полученных данных следует, что экспрессия Let7, миРНК-20a, миРНК-100, миРНК-10a-5p была в 1,5 раза ниже в миоматозном узле по сравнению с показателями в миометрии, а миРНК-26а, миРНК-29b, миРНК-10b - в 2 раза. Что касается миРНК-21, экспрессия данной миРНК была в 1,6 раза выше в миоматозном узле по сравнению с аналогичным показателем в миометрии.

Обсуждение

Избыточное накопление и ремоделирование являются ключевыми механизмами в формировании фибротических заболеваний. Клетки ЛМ характеризуются избыточным накоплением неорганизованного ВКМ. В ЛМ представлены глюкозаминогликаны и интерстициальный коллаген. Предполагается, что богатая ВКМ ригидная структура становится причиной аномальных маточных кровотечений и тазовых болей. Накопление ВКМ также связано с влиянием факторов роста: трансформирующего фактора роста b (ТФР b; Transforming growth factor, TGFb), активина-А, тромбоцитарного фактора роста (ТРФ), цитокинов фактора некроза опухоли a (Tumor necrosis factor, TNFa), стероидных гормонов (эстрогена, прогестерона) и миРНК.

Формирование опухолей не может быть полностью объяснено генетическими дефектами, имеют место также и эпигенетические факторы. К ним относятся метилирование ДНК, модификация гистонов, некодирующие РНК, гетерохроматизация. Изменения в экспрессии следующих микроРНК описаны в литературе: let7, миРНК-21, миРНК-93, миРНК-106b, миРНК-29, миРНК-200. миРНК длиной от 19 до 25 нуклеотидов представляет некодирующую малую РНК, обнаруженную в клетках эукариот, которая может регулировать процесс развития и участвует в важном механизме посттранскрипционной регуляции эукариотических клеток [1]. Исследования показали, что миРНК, составляющая менее 3% генома человека, регулирует до 30% генов. Кроме того, более 50% миРНК расположено в регуляторной области генов, связанных с опухолью, поэтому дисбаланс миРНК, вероятно, является одним из важных механизмов развития опухоли [2]. В последние годы все больше исследований показывают, что миРНК можно использовать в качестве потенциального диагностического онкомаркера.

В исследовании R. Lazzarini и соавт. при сравнении нормального миометрия с клетками ЛМ обнаружено 7 миРНК со сниженной экспрессией (миРНК-146b-5p; миРНК-335-3p; миРНК-335-5p; миРНК-135b-5p; миРНК-10a-3p; миРНК-10a-5p; миРНК-200a-3p) и 8 микроРНК с повышенной экспрессией (миРНК-146a-5p; миРНК-576-3p; миРНК-122-5p; миРНК-1246; миРНК-595; миРНК-658; миРНК-4284; миРНК-924). При помощи компьютерной программы DIANA-miRNAPath авторы определили, что вышеуказанные микроРНК участвуют в 3 сигнальных путях: взаимосвязь с рецепторами ВКМ (33 таргетных гена), адгезивные контакты (33 таргетных гена) и сигнальный путь Hippo (69 таргетных генов) [3]. 8 миРНК с повышенной экспрессией участвуют в сигнальных путях PI3K-AKT, опухолевых клеток, клеточного цикла и регуляции актинового итоскелета [3].

Проанализировав онлайн-базу данных таргетных генов миРНК и их функциональных особенностей микроРНК (https://миРНКdb.org/; https://dianalab.e-ce.uth.gr/home), была найдена информация об экспрессии микроРНК в эндометрий и яичниках, но нет информации об экспрессии в клетках миометрия или ЛМ.

В настоящем исследовании получены данные о том, что экспрессия миРНК-20а несколько снижена в миоматозном узле в сравнении с миометрием. В литературе найдены данные об онкосупрессивных свойствах данной миРНК, а также об участии в противоопухолевых процессах в клетках меланомы [4]. Таргетные гены: HMGN2, MED12.

Авторы выявили снижение уровня экспрессии миРНК-29b в миоматозном узле в сравнении с миометрием. Множество исследований подтверждают роль миРНК в онкологических процессах. К примеру, выявлена роль миРНК-29b в холангиокарциноме [5]. Также было выявлено, что миРНК-29b имеет отрицательную обратную связь с экспрессией гена FEM1B, который ингибирует пролиферацию в опухолевых клетках легких [6]. Таргетные гены: COL5A3, COL5A1, COL3A1, DNMT3A, ADAMTS10, COL6A1.

Экспрессия миРНК-100 повышена в миометрии в сравнении с миоматозным узлом. В исследовании B. Liu и соавт. выявлено, что миРНК-100-3р стимулируют пролиферацию клеток Сертоли и синтез ДНК, подавляют апоптоз [7].

В миометрии уровень экспрессии миРНК-10b достоверно выше в сравнении с миоматозным узлом. Анализируя стволовые раковые клетки, полученные у пациентов с раком молочных желез (РМЖ), было выявлено, что миРНК-10b способствует метастазированию и миграции, а также самообновлению клеток РМЖ через сигнальные пути [8].

Экспрессия миРНК-21-5р повышена в клетках РМЖ и, по результатам ROC-анализа, может быть использована для отделения больных РМЖ от здоровых с чувствительностью 86,7% и специфичностью 93,3% [9]. Также экспрессия этого микроРНК повышена в различных онкологических клетках, таких как рак прямой кишки, глиобластома, опухоли гипофиза. В представленном исследовании экспрессия миРНК-21-5р повышена в миоматозном узле в сравнении с миометрием.

МиРНК-10a-5p регулируют ген HOXA1 в клетках рака яичников (РЯ) и тем самым подавляют агрессивные фенотипы РЯ [10]. Другие исследования показывают, как микроРНК-10а-5р регулирует гиперпролиферацию и влияет на метастазы рака шейки матки [11].

Заключение

Авторы не выявили связь между уровнем экспрессии миРНК в миоматозных узлах в зависимости от объема оперативного лечения (миомэктомия или экстирпация матки) и в группах сравнения в зависимости от рецидива заболевания в анамнезе. Напротив, выявлено снижение уровня экспрессии let7, миРНК-20a, миРНК-100, миРНК-10a в 1,5 раза в миоматозном узле по сравнению с аналогичными показателями в миометрии, а микроРНК-26а, микроРНК-29b, микроРНК-10b - в 2 раза. Что касается миРНК-21, экспрессия данной миРНК была в 1,6 раза выше в миоматозном узле по сравнению с показателем в миометрии.

Во всех проанализированных источниках (https://миРНКdb.org, https://dianalab.e-ce.uth.gr/home) не представлены данные по экспрессии миРНК в миометрии и миоматозных узлах, что делает данное исследование особенно актуальным. Выявленные различия в экспрессии 8 миРНК из 20 изученных: let7, 20a, 26a, 29b, 100, 10b, 21, 10a - доказывают, что эти нуклеотидные последовательности играют ключевую роль в формировании ЛМ и могут быть диагностическими маркерами. Это дает стимул для дальнейшего углубленного исследования в данной области.

Литература/References

1. Lu T., Rothenberg M. MicroRNA. J Allergy Clin Immunol. 2018; 141 (4): 1202-7. DOI: https://doi.org/10.1016/j.jaci.2017.08.034

2. Camargo A., Remoli B., Portela L., et al. Transcriptomic landscape of male and female reproductive cancers: Similar pathways and molecular signatures predicting response to endocrine therapy. Mol Cell Endocrinol. 2021; 535: 111393. DOI: https://doi.org/10.1016/j.mce.2021.111393

3. Lazzarini R., Caffarini M., Delli Carpini G., et al. From 2646 to 15: differentially regulated microRNNAs between progenitors from normal myometrium and leiomyoma. Am J Obstet Gynecol 2020; 222: 596.e1-9.

4. De Tomi E., Campagnari R., Orlandi E., et al. Upregulation of microRNA-34a-5p, microRNA-20a-3p and microRNA-29a-3p by onconase in A375 melanoma cells correlates with the downregulation of specific onco-proteins. Int J Mol Sci. 2022; 23 (3): 1647. DOI: https://doi.org/10.3390/ijms23031647 Epub 2022 Jan 31.

5. Cao K., Li B., Zhang Y., et al. microRNA-29b restrains cholangiocarcinoma progression by relieving DNMT3B-mediated repression of CDKN2B expression. Aging (Albany NY). 2021; 13 (4): 6055-65. DOI: https://doi.org/10.18632/aging.202549

6. Zhang H., Wang R., Deng Q. microRNA-29b regulates lung cancer progression by downregulating FEM1B and inhibiting the FOX01/AKT pathway. Comput Math Methods Med. 2022; 2022: 3110330. DOI: https://doi.org/10.1155/2022/3110330 Epub 2022 Aug 14.

7. Liu B., Cui Y., Chen W., et al. microRNA-100-3p controls the proliferation, DNA synthesis, and apoptosis of human Sertoli cells by binding to SGK3. Front Cell Dev Biol. 2021; 9: 642916. DOI: https://doi.org/10.3389/fcell.2021.642916 Epub 2021 May 11.

8. Bahena-Ocampo I., Espinosa M., Ceballos-Cancino G., et al. microRNA-10b expression in breast cancer stem cells supports self-renewal through negative PTEN regulation and sustained AKT activation. EMBO Rep. 2016; 17 (5): 648-58. DOI: https://doi.org/10.15252/embr.201540678

9. Liu M., Mo F., Song X., et al. Exosomal microRNA-21-5p is a biomarker for breast cancer diagnosis. PeerJ. 2021; 9: e12147. DOI: https://doi.org/10.7717/peerj.12147 Epub 2021 Sep 17.

10. Liu L., Sun X., Yang C., et al. microRNA -10a-5p restrains the aggressive phenotypes of ovarian cancer cells by inhibiting HOXA1. Kaohsiung J Med Sci. 2021; 37 (4): 276-85. DOI: https://doi.org/10.1002/kjm2.12335

11. Gu Y., Feng X., Jin Y., et al. Upregulation of microRNA-10a-5p promotes tumor progression in cervical cancer by suppressing UBE2I signaling. J Obstet Gynaecol. 2023; 43 (1): 2171283. DOI: https://doi.org/10.1080/01443615.2023.2171283

Материалы данного сайта распространяются на условиях лицензии Creative Commons Attribution 4.0 International License («Атрибуция - Всемирная»)