Молекулярные сигнатуры эндометрия, ассоциированные с "маточным фактором" бесплодия

• Полина Мирослава Леонидовна
• Радзинский Виктор Евсеевич
• Михалева Людмила Михайловна
• Витязева Ирина Ивановна
• Михалев Сергей Александрович

Резюме

Цель исследования - изучить "рецептивные" и иммунные характеристики эндометрия бесплодных женщин в фазу "имплантационного окна".

Материал и методы. Обследована 171 женщина с выделением групп с бесплодием: неясного генеза (n=21), трубно-перитонеальным (ТПБ) (n=74), ассоциированным с наружным генитальным эндометриозом (НГЭ) (n=22), хроническим эндометритом (ХЭ) (n=36), с "тонким" эндометрием (n=8). Контрольную группу составили 10 здоровых фертильных женщин.

Авторы провели оценку содержания в cыворотке крови витамина D (25(ОН)D), гистероскопию, пайпель-биопсию эндометрия в фазу "имплантационного окна" с патоморфологическим и иммуногистохимическим исследованием экспрессии рецепторов стероидных гормонов (эстрадиола ER и прогестерона PR), рецепторов к витамину D (VDR), цитокинов (TNFα, IL-10). ХЭ подтверждали при выявлении CD138⁺, пролиферативную активность эндометрия - при гиперэкспрессии Ki-67.

Результаты. После иммуногистохимического исследования, с учетом данных гистероскопии и патоморфологических заключений молекулярные сигнатуры эндометрия внутри каждой группы с бесплодием были неоднородны: с нарушенным иммунным статусом (n=42), пролиферативный (n=40), диспластический (n=47), хроническое воспаление (ХЭ) (n=30), "нормальный" эндометрий (n=10). Вариант "нормального" эндометрия был объединен с данными контрольной группы (n=22).

При оценке содержания 25(ОН)D у бесплодных женщин достоверные отличия про данному показателю от группы контроля [43 (36; 52,5)] были выявлены при диспластическом фенотипе [26,8 (24,5; 40,5); p=0,005], пролиферативном [23,5 (15,3; 48,0); p=0,009] и при ХЭ [28,5 (25,5; 38,8); p=0,02].

"Рецептивный" профиль эндометрия выявлен у 22 женщин (10 фертильных и 12 - с фенотипом "нормального" эндометрия из группы с ТПБ), "нерецептивный" профиль определен у всех женщин с ХЭ, 89,5% с пролиферативным и диспластическим фенотипом, 62,5% - с нарушенным иммунным статусом. Нарушение рецептивности эндометрия подтверждает снижение индекса соотношения экспрессии в клетках стромы средних значений рецепторов к гормонам PR/ER (в отличие от группы контроля и фенотипа "нормального" эндометрия - 2,1): при пролиферативном - в 2,6 раза (p<0,05), при ХЭ - в 1,5 раза (p<0,05) и диспластическом фенотипе - в 1,9 раза (p<0,05). Уровень экспрессии VDR в эндометрии женщин со всеми фенотипами, кроме диспластического, оказался достоверно выше, чем в группе с "нормальным" эндометрием в обоих компартментах (p<0,001), при ХЭ и нарушенном иммунном статусе в эпителии желез - сопоставим, в строме - достоверно ниже при воспалении (p<0,001).

Молекулярный профиль цитокинов и иммунорегуляторного индекса TNF α/IL-10 при различных фенотипах отличался от данных группы контроля ("нормального" эндометрия - 1,1 в эпителии желез и 2,3 - в строме): при нарушенном иммунном статусе - 1,0 и 0,94 соответственно; при диспластическом - 1,0 и 0,7 соответственно; при ХЭ - 2,5 и 2,2 соответственно; при пролиферативном в эпителии желез - 1,5.

Заключение. Выявлены основные молекулярные сигнатуры эндометрия и детерминанты его дисфункции при "маточном факторе" бесплодия. Показано, что приобретение эндометрием "рецептивного" статуса реализуется под влиянием иммунных реакций, модулируемых активностью цитокинов.

Нарушение экспрессии стероидных гормонов (ER и PR), опосредованно влияющих на рецептивность иммунных факторов (цитокины TNFα/IL-10, VDR), позволяет говорить о выявленных дефектах механизмов децидуализации стромы и секреторного потенциала желез, генов контроля процессов клеточного метаболизма. Подтверждена концепция, что благоприятная имплантация бластоцисты предполагает рецептор-опосредованную иммунную доминанту умеренной провоспалительной децидуальной среды.

Ключевые слова:бесплодие; фаза "имплантационного окна"; иммуногистохимическое исследование; молекулярный фенотип; цитокины; "рецептивный" эндометрий

С позиций молекулярных механизмов формирования восприимчивости к эмбриону эндометрий остается самой неисследованной тканью женского организма [1], несмотря на множество научных работ. Основную роль в структуре изменений эндометрия, ассоциированных с "маточным фактором" бесплодия, отводят воспалительным и дисгормональным заболеваниям [2]. Представление об эндометриальной дисфункции, обозначенной как "-обратимые, условно обратимые морфофункциональные изменения, в основе которых лежат нарушения молекулярных механизмов, приводящие к нарушению имплантации, плацентации и гибели эмбриона-" [3], объясняет внимание специалистов к области молекулярной репродуктологии. Очевидно, причины более 60% неудачных попыток имплантации у женщин в программах вспомогательных репродуктивных технологий (ВРТ) следует искать в нарушении экспрессии маркеров, регулируемых активностью стероидных гормонов, более исследованы из которых пиноподии, интегрины αvβ3, LIF, Е-катгерины, HOX-гены и т.д. [4-6].

Сообщения о развитии оптимальной для локализации бластоцисты, адгезии, инвазии и имплантации в микросреде с дифференцировкой стромальных клеток и вовлеченностью пула иммунокомпетентных клеток позиционируют необходимость изучения их роли в формировании "упорядоченной" децидуальной реакции эндометрия [7, 8]. Данные о медиаторах иммунной системы, факторах роста и цитокинах, синтезируемых иммунокомпетентными клетками, способствующих развитию "фертильного" эндометрия, с помощью внутриклеточных сигналов посредством аутокринных, паракринных и эндокринных механизмов представлены фрагментарно и не систематизированы [9-11].

Выявление особенностей популяционного состава иммунных клеток, дисрегуляции процессов роста и дифференцировки ткани на фоне измененной продукции сигнальных пептидов будет способствовать пониманию тонких механизмов повреждения эндометрия в период "окна имплантации".

Данные о влиянии дефицита витамина D на снижение естественной фертильности в программах ВРТ базируются на способности его активной формы [1,25(OH)₂D] как многоцелевого стероидного гормона с аутокринным, интракринным или паракринным действием, к стимуляции продукции эстрадиола, эстрона и прогестерона [12].

Выявление VDR на поверхности большинства типов иммунных клеток (моноцитов, дендритных клеток и Т-лимфоцитов), в децидуальной ткани в начале гестации позволяет предполагать косвенную роль 25(ОН)D в регуляции циклических изменений эндометрия как кофактора сигнальных путей в децидуальной ткани [13, 14]. Противоречивые данные о влиянии коррекции недостаточности витамина D и особенностях экспрессии VDR на способность эндометрия к имплантации требуют уточнения их роли в реализации механизмов межклеточной коммуникации и развитии определенного иммунного ответа при нарушении трансформации стромальных фибробластов.

Очевидно, формированию представлений о взаимодействии при "маточном факторе" бесплодия децидуальных и иммунокомпетентных клеток эндометрия способствует только комплексное исследование молекулярных сигнатур полноценности "имплантационного окна". Полагаем, решение проблемы "несостоятельного" эндометрия, определяющего вероятность нарушения имплантации, а при наступлении беременности "внутриутробного программирования заболеваний" заключается в выявлении спектра молекулярно-биологических маркеров для прогнозирования и ранней диагностики "маточного фактора" бесплодия.

Цель исследования - изучить "рецептивные" и иммунные характеристики эндометрия бесплодных женщин в период "окна имплантации".

Материал и методы

Выполнено проспективное исследование, в котором приняла участие 171 женщина репродуктивного возраста с бесплодием, обратившихся как впервые, так и после неэффективных попыток экстракорпорального оплодотворения (ЭКО).

Отбор и обследование супружеских пар осуществляли на базе отделения вспомогательных репродуктивных технологий ФГБУ "НМИЦ эндокринологии" Минздрава России (Москва), гинекологического отделения ГБУЗ ГКБ № 36 ДЗМ, Медицинского центра женского здоровья г. Москвы.

В ходе распределения женщин по группам ориентировались на диагнозы предшествующего этапа обследования и ведения. Выделены группы женщин с бесплодием (n=171): неясного генеза (БНГ) (n=21), трубно-перитонеальным (ТПБ) (n=74), ассоциированным с наружным генитальным эндометриозом (НГЭ) (n=22), с ХЭ (n=36), с "тонким" эндометрием (n=8). Контрольную группу составили 10 здоровых фертильных женщин.

Критерии включения в исследование: бесплодные женщины 25-40 лет; с БНГ, верифицированным ХЭ (морфологически, иммуногистохимически); с ТПБ, бесплодием на фоне НГЭ; "тонким" эндометрием (<7 мм в период "окна имплантации"); получение добровольного информированного согласия на проведение исследования и забор материала.

Критерии исключения: бесплодие любого другого генеза, в том числе наличие мужского фактора бесплодия, соматические заболевания в стадии декомпенсации, острые воспалительные заболевания органов малого таза и инфекционные заболевания (туберкулез, сифилис, ВИЧ-инфекция, вирусный гепатит, острый генитальный герпес), аутоиммунные, психические заболевания, использование внутриматочного девайса на момент исследования, отсутствие антибактериальной терапии не менее чем за 1 мес до включения в исследование.

Обследование бесплодных женщин проводили в соответствии с приказом Минздрава России от 30.08.2012 № 107н "О порядке использования вспомогательных репродуктивных технологий, противопоказаниях и ограничениях к их применению" (ред. от 11.06.2015 и от 01.02.2018). Все пациентки подписали информированное согласие на участие в исследовании.

Обследование бесплодных женщин включало оценку жалоб, анамнеза, общий и гинекологический осмотр, стандартное лабораторное исследование крови и мочи. Проводилось исследование содержания в венозной крови активного метаболита 25-гидроксикальциферола [25(ОН)D] на 6-8-й день после овуляции хемилюминесцентным методом по стандартной методике (нормальный уровень 25(OH)D - 30-100 нг/мл, недостаточность - от 20 до 30 нг/мл, дефицит - 10-20 нг/мл).

Забор биоптата для патоморфологического исследования методом аспирационной пайпель-биопсии выполняли во вторую фазу менструального цикла [на 20-24-й день менструального цикла, 6-8-й день после пика овуляции), в первую фазу дополнительно - при сонографических и/или гистероскопических признаках ХЭ, ПЭ (полипа эндометрия), гиперпластических процессах эндометрия (ГПЭ)] (на 7-9-й день). В фазу "имплантационного окна" выполняли аспирационную пайпель-биопсию эндометрия.

Патоморфологическое и иммуногистохимическое исследование эндометрия проводили по стандартной методике на базе НИИМЧ им. акад. А.П. Авцына (Москва). Полученные биоптаты фиксировали 10% забуференным раствором формалина в течение 24 ч, далее выполняли стандартную гистологическую проводку и заливку в парафиновые блоки. Гистологические срезы толщиной 4 мкм были изготовлены с использованием ротационных микроскопов Sacura и окрашены гематоксилином и эозином. Исследование препаратов проводили с помощью светового микроскопа с увеличением от ×50 до ×1000.

Иммуногистохимическое (ИГХ) исследование эндометрия проводили в фазу "имплантационного окна" (ЛГ+7) для оценки экспрессии цитокинов в эпителии желез и клетках стромы (в данной работе представлены TNFα, IL-10).

Производилась постановка позитивных и негативных контрольных реакций.

Анализ результатов оценки экспрессии цитокинов (с антителами к ФНО, ИЛ-10, представляющие собой клоны JM113-01, GT5111, GeneTex, USA), ER (клон EP1, фирма DAKO, Дания, ready-to-use) и PR (клон Y85, Сell Marque, USA) проводили с учетом количества окрашенных клеток и интенсивности их окраски. Подсчет Histo-score (HS) проводился по формуле: HS=Σ(Pi × i), где Pi - процент окрашенных клеток для каждой интенсивности (от 0 до 100%), i - интенсивность окрашивания со значением 0 (отсутствие), 1 - слабое (светло-коричневое), 2 - умеренное (коричневое) и 3 - сильное (темно-коричневое). Градация баллов: 0-10 - отсутствие экспрессии, 11-100 - слабая экспрессия, 101-200 - умеренная, 201-300 - выраженная.

Результаты экспрессии VDR (поликлональные, Ventana, USA) рецепторы на поверхности клеток стромы и гландулоцитов желез были представлены в процентном выражении. С целью верификации ХЭ использовали маркер плазматических клеток CD 138⁺ (клон MI15, DAKO), пролиферативную активность эндометрия оценивали на основании экспрессии в эпителиоцитах и клетках стромы ядерного белка Ki-67 (клон SP6, Cell Marque). Препараты изучали при помощи светового микроскопа Leica DMLB со стандартным набором оптики.

Протокол наблюдения за пациентами и программа обследования одобрены локальным этическим комитетом Медицинского института ФГАОУ ВО РУДН им. П. Лумумбы (Москва), исследование выполнено в соответствии с принципами Хельсинкской декларации Всемирной ассоциации "Этические принципы научных и медицинских исследований с участием человека".

Статистический анализ данных выполнен в пакете IBM SPSS STATISTICS 22.

Проверку нормальности распределения параметров проводили с использованием критерия Шапиро-Уилка. Анализ качественных переменных выполняли путем построения таблиц сопряженности с применением критерия согласия χ² Пирсона, при небольшом числе наблюдений (<5) использовали точный критерий Фишера. Количественные признаки представлены в виде медианы (Ме) и верхнего и нижнего квартилей (25-й и 75-й процентили). Для анализа количественных признаков применяли U-критерий Манна-Уитни, для множественного сравнения - критерий Краскела-Уоллиса. Статистически значимыми считали различия при р<0,05.

Результаты

После ИГХ-исследования с учетом данных гистероскопии и патоморфологических заключений в группах бесплодных женщин выделены молекулярные сигнатуры эндометрия: при БНГ - с нарушенным иммунным статусом (n=10) и диспластическим фенотипом (n=11); ТПБ - пролиферативным фенотипом (n=12), ХЭ (n=20), вариантом "нормы" (n=12), идентичным по показателям в контрольной группе, диспластическим фенотипом (n=18), нарушенным иммунным статусом (n=12); НГЭ - нарушенным иммунным статусом (n=10) и пролиферативным фенотипом (n=12); ХЭ - истинное хроническое воспаление (n=10), пролиферативным (n=8), при сочетании с ПЭ (n=8); с диспластическим (n=10); "тонким" эндометрием (диспластическим) (n=8). Эталонными выбраны показатели здоровых фертильных женщин (контрольная группа, n=10).

Группировка выделенных вариантов показала, что основу "маточного фактора" бесплодия составляют фенотипы: с нарушенным иммунным статусом, пролиферативный, диспластический, хроническое воспаление (ХЭ), "нормальный" эндометрий.

Данные о содержании 25(ОН)D в периферической крови женщин с различными фенотипами эндометрия представлены на рис. 1.

При оценке содержания 25(ОН)D у бесплодных женщин достоверно больший средний показатель выявлен в группе с фенотипом нарушенного иммунного статуса [41,5 (26; 51,5) нг/мл], практически в 1,5 раза выше, чем при диспластическом [26,8 (24,5; 40,5); p=0,04] и пролиферативном фенотипе [23,5 (15,3;48,0); p=0,03]. Достоверные отличия значений от контрольной группы [43 (36; 52,5)] выявлены при диспластическом фенотипе (p=0,005), пролиферативном (p=0,009) и ХЭ [28,5 (25,5; 38,8); p=0,02].

При ИГХ-исследовании биоптатов эндометрия выявлена 100% положительная ядерная экспрессия ER и PR со статистически значимыми различиями в количестве окрашенных клеток эпителия желез и стромы и интенсивности окрашивания при различных фенотипах.

Экспрессия рецепторов стероидных гормонов у здоровых фертильных женщин (умеренная в эпителии желез, в строме преобладание PR в сравнении с ER) выступала эталоном при градации образцов в группах. Полученные результаты позволяют утверждать о рецептивной активности эндометрия при молекулярных фенотипах (табл. 1).

"Рецептивный" профиль эндометрия выявлен у 22 женщин (10 фертильных и 12 - с фенотипом "нормального" эндометрия из группы с ТПБ), в группе с нарушенным иммунным статусом - в 3,6 раза чаще, чем при пролиферативном и диспластическом фенотипах (p<0,05).

"Нерецептивный" профиль определен у всех женщин с ХЭ, 89,5% - с пролиферативным и диспластическим фенотипом, что в 1,4 раза реже, чем в группе с нарушенным иммунным статусом (p<0,05). При пролиферативном и диспластическом фенотипах отличный от "нормы" уровень экспрессии рецепторов в ядрах эпителиоцитов желез и клеток стромы эндометрия отмечали достоверно чаще, чем при других вариантах эндометриального "ответа" - в 1,4 раза (p<0,001).

Детализация особенностей экспрессии рецепторов стероидных гормонов в эпителиоцитах желез и клетках стромы эндометрия при различных фенотипах приведена с выделением "рецептивного" и "нерецептивного" профиля в табл. 2.

Сравнительный анализ экспрессии рецепторов стероидных гормонов при различных иммунных сигнатурах эндометрия осуществляли по отношению к показателям контрольной группы.

При нарушенном иммунном статусе уровень экспрессии рецепторов к стероидным гормонам в железистом эпителии был повышен, к PR в большей степени - в 1,4 раза (p<0,001), чем к ER - в 1,1 раза (p<0,001). Количество клеток, экспрессирующих рецепторы к половым стероидным гормонам в строме эндометрия, в группах статистически значимо не отличалось. В группе женщин с диспластическим фенотипом был выявлен достоверно низкий по сравнению с данными группы контроля уровень экспрессии ER и PR в обоих компартментах эндометрия (p<0,001).

В группе женщин с пролиферативным фенотипом был выявлен достоверно повышенный в сравнении с группой контроля уровень экспрессии ER в эпителии желез - в 1,8 раза (p<0,001), в строме - в 1,2 раза (p<0,001) и сниженный уровень экспрессии PR в обоих компартментах эндометрия, в строме - в большей степени (в 2,3 раза) (p<0,001), чем в гландулоцитах желез - в 1,1 раза (p<0,001). При ХЭ снижение экспрессии рецепторов к стероидным гормонам прослеживалось как в железистом, так и стромальном компартменте, в большей степени за счет PR - в 2 раза меньше в сравнении с контролем (p<0,001).

Данные о соотношении уровня экспрессии PR/ER в строме эндометрия в фазу "имплантационного окна" бесплодных женщин представлены на рис. 2.

Нарушение рецептивности эндометрия подтверждает снижение индекса экспрессии PR/ER в клетках стромы: при пролиферативном - в 2,6 раза (p<0,05), при ХЭ - в 1,5 раза (p<0,05) и диспластическом фенотипе - в 1,9 раза (p<0,05).

Результаты ИГХ-исследования экспрессии VDR в эндометрии бесплодных женщин в фазу "имплантационного окна" в зависимости от "рецептивной" активности приведены в табл. 3.

Профиль экспрессии VDR в эндометрии женщин со всеми фенотипами, кроме диспластического, оказался достоверно выше, чем в группе с "нормальным" эндометрием в обоих компартментах (p<0,001). Профиль экспрессии рецепторов к витамину D при фенотипе хронического воспаления в эпителии желез оказался сопоставим с таковым при нарушенном иммунном статусе, в строме - был достоверно ниже (p<0,001). При диспластическом фенотипе эндометрия количество клеток, экспрессирующих VDR в эпителии желез и строме, было значимо меньше, чем в контроле (p=0,00) и остальных группах (p<0,001).

Фенотипический профиль молекулярных маркеров в железистом компартменте эндометрия при нарушенном иммунном статусе отражает снижение показателей TNFα и IL-10 в сравнении с контрольной группой - в 1,3 раза (p<0,001) и в 1,2 раза соответственно (p<0,001), соотношение TNFα/IL-10 составило 1,0. В стромальных клетках эндометрия тенденция была аналогична таковой в эпителии желез; индекс TNFα/IL-10 составил 0,94.

Отличием диспластического типа эндометрия бесплодных женщин выступало снижение в железистых клетках экспрессии всех маркеров в сравнении с показателями группы контроля: TNFα - в 2 раза (p<0,001), IL-10 - в 1,8 раза (p<0,001). Индекс TNFα/IL-10 был равен 1,0. В стромальных клетках эндометрия была снижена экспрессия TNFα - в 4,6 раза (p<0,001), IL-10 - в 2,9 раза (p<0,001); индекс TNFα/IL-10 - 0,7. Молекулярный профиль женщин с пролиферативным фенотипом отличался сбалансированностью в сравнении с контролем про- и противовоспалительных цитокинов в эпителии желез: незначительное возрастание экспрессии TNFα наблюдалось только в эпителиоцитах желез (p<0,001), снижение IL-10 - в 1,3 раза в эпителии желез (p<0,001), в 1,6 раза - в строме (p<0,001). Соотношение TNFα/IL-10 в эпителии желез составило 1,5. Особенности иммунорегуляции при фенотипе ХЭ обусловлены избыточностью в железистом компартменте эндометрия провоспалительных цитокинов в сравнении с противовоспалительными [повышение TNFα, снижение IL-10 - в 2 раза (p<0,001)]. Иммунорегуляторный индекс TNFα/IL-10 составил 2,5. В строме эндометрия экспрессия TNFα оказалась достоверно выше, чем в контроле, в 1,2 раза (p<0,001), содержание IL-10 увеличилось в 1,8 раза (p<0,001).

Обсуждение

Особенности рецепторного профиля при "нормальном" фенотипе эндометрия согласуются с данными о том, что регулируемое прогестероном снижение ERα в середине секреторной фазы - критически необходимое событие для экспрессии определенных генов [15]. Полагаем возможным заявлять о формировании "рецептивного" эндометрия в присутствие равновесной экспрессии подтипов Th1-провоспалительных и Т-регуляторных (Treg) клеток. Генерация умеренной воспалительной реакции и рекрутирование иммунных клеток для материнской иммунной толерантности обусловлены дифференцировкой под влиянием прогестерона Th-2-ориентированных лимфоцитов и продукцией прогестерон-индуцированного блокирующего фактора (PIBF), приводящего к подавлению активности NK-клеток. Преобладание у большинства женщин с фенотипом "нормального" эндометрия адекватного уровня витамина D в периферической крови обеспечивает оптимальную для децидуализации и имплантации воспалительную иммунную реакцию при умеренной экспрессии VDR. Полученные результаты согласуются с данными других авторов [16]. Вероятно, интерфейс "витамин D-VDR" эффективен не только в реализации эффекторных функций Treg [17], но и в отношении антипролиферативного влияния рецепторов в среднюю секреторную фазу, в сравнении с ранней секреторной. Выявлена обратная связь между реализацией сигнала PR и уровнем экспрессии VDR (r=-0,53).

Фенотип с нарушенным иммунным статусом

Формирование выборки женщин с фенотипом нарушенного иммунного статуса основано на результатах экспрессии в эндометрии маркеров, указывающих на функциональную дисрегуляцию иммунной системы в период "окна имплантации". Нарушение гистологического датирования эндометрия ("нерецептивный" при констатации средней стадии фазы секреции) у 21,9% женщин с данным фенотипом указывает на критичность учета маркеров тканевой "зрелости", особенно в протоколах экстракорпорального оплодотворения (ЭКО)/ЭКО-ИКСИ (ICSI - Intra Cytoplasmic Sperm Injection), интрацитоплазматическая инъекция сперматозоида в яйцеклетку) для синхронизации с развивающимся эмбрионом. Параметры "нерецептивного" эндометрия при данном фенотипе (62,5%) были обусловлены незначительным возрастанием в эпителии желез экспрессии ER, умеренным ростом экспрессии PR (в 1,4 раза). Нарушение секреторной зрелости эндометрия считают следствием отклонения уровня PR от характерных для "окна имплантации" за счет дисрегуляции экспрессии ER или изменения структуры самого рецептора. Снижение способности эндометрия к принятию бластоцисты при эталонном индексе соотношения стероидных рецепторов у 62,5% женщин предполагаемо обусловлено молекулярно-адаптационным профилем фенотипа.

Соотношение молекулярных медиаторов и эффекторов локального иммунного микроокружения (более низкое, чем в контроле), уровень экспрессии в эпителии желез эндометрия и маркеров TNFα и IL-10 в строме - подтверждает причастность к нарушению передачи сигнала рецепторам стероидных гормонов. Дисбаланс цитокиновых каскадов эндометрия и отсутствие провоспалительного Th1-сдвига в период "имплантационного окна" нарушает способность клеток стромы к дифференциации в высокоспециализированные, определяя невосприимчивость рецепторного аппарата к сигналам регуляции процесса децидуализации. Нарушение экспрессии генов вследствие смещения "окна имплантации" представлено при рецидивирующих неудачах имплантации, необъяснимом бесплодии [18]. Особенности молекулярного профиля рассматриваемого фенотипа могут быть причиной неудач имплантации вследствие снижения продукции PIBF, синтезируемого лимфоцитами, экспрессирующими рецептор прогестерона, и NK-клетками в периферической крови и децидуальной оболочке [19]. Репродуктивная дисфункция также может быть связана с нарушением иммунной толерантности, вызванным снижением количества и функции Treg-клеток [20].

Концепция фенотипа нарушенного иммунного статуса эндометрия детерминирована повышенной экспрессией VDR в сравнении с данными группы контроля. Подтверждение неблагоприятных в период "окна имплантации" иммунологических последствий недостатка витамина D (75,0%) связывают с дисбалансом Th1/Th2 и срывом регуляции В-звена иммунитета и NK-клеток.

Несостоятельность специфического иммунного ответа ввиду структурных и/или функциональных дефектов клеток детерминировала нарушение взаимодействия комплекса "VDR-локальный 1,25-дигидроксивитамин", ответственного за регуляцию экспрессии генов в период имплантации. Нарушение "рецептивной" опосредованности иммунными реакциями подтверждает положительная корреляция экспрессии в эпителии желез маркеров VDR и PR (r=0,45). Вероятно, отсутствие реакций адекватного иммунного воспаления, индуктора рекрутирования иммунных клеток, неоваскуляризации и дифференцировки стволовых клеток соотносится с подавлением устойчивости структур эндометрия к стрессорным молекулярным сигналам.

Диспластический фенотип эндометрия

Метаболическую неполноценность клеточного пласта эндометрия при диспластическом фенотипе подтверждало преобладание "нерецептивного" профиля (91,5%) с подавлением экспрессии рецепторов к стероидным гормонам в эпителии желез и строме в сравнении не только с контролем, но и другими группами. Повреждения рецепторного аппарата вследствие выраженной десквамации гландулоцитов маточных желез описаны как причина отрицательных исходов программ ЭКО и нарушения имплантации [21]. Снижение рецепторной активности эндометрия при диспластическом фенотипе соответствовало морфологическому статусу неполноценной фазы секреции с преобладанием гипопластическо-диспластического типа (76,6%).

Причиной несостоятельности рецепторного аппарата может выступать метаболический дисбаланс, сопряженный с избыточной продукцией проапоптотических белков и дисрегуляцией межклеточных взаимодействий [22]. Наличие у 72,3% женщин с диспластическим фенотипом эндометрия недостатка 25(ОН)D соответствует данным о его сочетании с недостаточной толщиной слизистой матки при анализе исходов ЭКО/ИКСИ [23].

Дефицит 25(ОН)D рассматривают в качестве триггера нарушений иммунного гомеостаза, с превалированием у половины женщин с бесплодием цитокиновых реакций Th1-типа [24].

Низкий уровень экспрессии при диспластическом фенотипе VDR, регулирующем транскрипцию генов в иммунных клетках, является одной из причин нарушения иммуномодулирующего воздействия в период "окна имплантации". Выявленные особенности рецепторного статуса эндометрия (ER и PR, VDR) позволяют утверждать, что утрата клеточного кворума реализуется в нарушении способности к синхронизации ответов на сигнальные каскады других клеток.

Выраженное снижение экспрессии TNFα и IL-10 в сравнении с контролем отмечено в железистых клетках и строме. Взаимозависимость нарушений иммунных каскадов и локального метаболизма подтверждает отрицательная связь экспрессии в строме TNFα и VDR (r=-0,41). Нарушения адаптационных возможностей иммунной системы при диспластическом фенотипе заключаются в "бедном иммунном ответе", сочетанном с истощением или блокированием энергетических субстратов.

Пролиферативный фенотип эндометрия

Морфологическую основу пролиферативного фенотипа составляли ПЭ (30,0%), очаговая ГПЭ (37,5%) и микрополипы (32,5%), указывающие на разную степень избыточной митогенной активности структур эндометрия, несмотря на лечебно-диагностические мероприятия по поводу гиперпластических процессов эндометрия у 62,5% женщин в анамнезе.

Выявленные особенности позволяют сформулировать концепцию иммунорегуляторного повреждения экспрессии ключевых молекул, контроля процесса имплантации и предположить развитие "нерецептивного" эндометрия в 87,5% случаев. Пролиферативную направленность пула клеток эндометрия подтверждает повышенная экспрессия ER в эпителии желез (в 1,8 раза) и строме (в 1,2 раза) в сравнении с контролем на фоне гипоэкспрессии PR (в 1,1 раза и 2,3 раза соответственно), индекс PR/ER=0,8. Полученные данные соответствуют заключению о дисбалансе процессов пролиферации и апоптоза вследствие нарушения экспрессии или модуляции действия эстрогенов на клеточном уровне [25]. Пролиферативный характер изменений эндометрия (микрополипы, ПЭ, ГПЭ) доказывает возрастание экспрессии протеина Ki-67 (от 6,0 до 19,0%) в сравнении с контролем и другими фенотипами.

Молекулярный профиль женщин с пролиферативным фенотипом эндометрия отличался умеренной экспрессией TNFα и сниженным уровнем IL-10, кофакторность которых доказывала средняя положительная корреляционная связь (r=0,47). Возрастание экспрессии VDR подавляло передачу сигнала PR (r=-0,47).

Корреляционные связи указывали на нарушение PR-опосредованных эффектов при низком уровне IL-10 (r=-0,46) и гиперэкспрессии ER (r=-0,44) в строме. Полученные нами данные подтверждают, что нарушения взаимодействия цитокинов и их рецепторов участвуют в каскаде сложных многоэтапных механизмов и, как следствие, в развитии гиперпластических процессов эндометрия за счет регуляции процессов пролиферации, дифференцировки и апоптоза клеток [25]. Варианты морфологического субстрата (очаговая ГПЭ, ПЭ и микрополипы) обусловлены различной метаболической активностью клеток эндометрия, определяемой нарушением "кворума" локальных иммунно-гормональных ресурсов (длительность воздействия триггера и способность "поврежденной" ткани к репарации). Вероятно, развитие пролиферативных изменений у 40,0% женщин с ХЭ сопряжено с геномной нестабильностью эпителия эндометрия, зависящей от эпигенетических факторов. Возрастание пролиферативной активности (PR/ER=0,8, Ki-67) выявлено непосредственно в ткани железистых и железисто-фиброзных ПЭ, в отличие от прилежащей ткани неизмененного эндометрия.

Фенотип хронического воспаления

Особенности рецептивного профиля эндометрия при фенотипе ХЭ в фазу "имплантационного окна" заключались в некоторой гипоэкспрессии ER в железах и строме. Снижение экспрессии PR в 2 раза в эпителии желез обусловлено персистенцией ER в строме - фибропластической трансформацией. Изменения архитектоники при инфильтрации стромы плазматическими клетками с развитием дисфункции эндометрия представлены также в других источниках [8, 9]. Нарушение экспрессии рецепторов стероидных гормонов подтверждает не только нарушение децидуализации стромы, но и ее васкуляризации [26], при которых отсутствие сдвига PR из эпителия в клетки стромы препятствует подавлению экспрессии ER в эпителиоцитах желез. Отсутствие полноценного прогестерон-рецепторного взаимодействия при ХЭ, подтверждаемого не только количеством экспрессируемых рецепторов к гормонам, но и их соотношением (PR/ER=1,1), определяли независимо от морфологической картины (полноценная секреторная трансформация/несоответствие фазе менструального цикла) и уровня прогестерона в периферической крови. Данные об отсутствии корреляции содержания гормона и маркеров рецептивности эндометрия также приведены в работах других авторов [27].

Воспалительный тип иммунорегуляции при ХЭ определяла избыточность экспрессии в эндометрии TNFα при снижении IL-10 как в эпителии желез, так и в строме. Индекс TNFα/IL-10 - 2,5 (при норме 1,1 в железистых клетках) подтверждает нарушение молекулярных взаимодействий в иммунокомпетентных клетках.

Полученные нами данные позволяют утверждать, что аномальное иммунное микроокружение в период "имплантационного окна" при фенотипе ХЭ обусловлено повышенной продукцией и нарушением передачи сигналов TNFα. Избыточная индукция триггера митотической активности может быть связана с микрополипозом, уровень которого рассматривают как гистероскопический маркер ХЭ [28, 29]. Снижение экспрессии IL-10 при ХЭ предположительно является причиной количественного или функционального дефицита противовоспалительного клона Treg-клеток. Таким образом, основу патогенеза фенотипа хронического воспаления эндометрия составляет нарушение рецептивности на фоне локального иммунного дисбаланса, с превалированием провоспалительного Th1-подтипа.

При фенотипе хронического воспаления эндометрия корреляция экспрессии в эпителии желез ER и PR (r=0,6) подтверждает важную роль пролиферативной фазы менструального цикла, нарушение локального хода событий которой детерминирует морфофункциональную недостаточность секреторной фазы. Неблагоприятное влияние на имплантацию эмбриона связывают с развитием и фазовой перестройкой всех структур эндометрия в воспалительной микросреде [30].

При фенотипе ХЭ преобладает дефицит 25(ОН)D в периферической крови (86,7%), и это позволяет считать, что блокирование иммунорегуляторных эффектов витамина приводит к усилению иммунных реакций Th1-типа. Достоверность наших заключений подтверждают данные о способности при бактериальной инфекции плаценты, нейтрофилов и макрофагов, обработанных комбинацией липополисахарида и 1,25(OH)₂D, к фагоцитозу [31]. Ранее были представлены данные о нарушении иммунной регуляции периода "имплантационного окна" при отклонении содержания витамина D от референтных значений: поляризация Th1-цитокинов (IFN-γ, TNFα, IL-1α и IL-1β), высокая цитотоксичность NK-клеток, снижение секреции Th2-цитокинов (IL-10) [32]. Суммация представленных в работе результатов позволяет утверждать о срыве при недостатке и дефиците витамина D в сыворотке крови компенсаторно-приспособительных механизмов - иммунной толерантности и противоинфекционной защиты.

Полученные данные отражают способность VDR-маркированных клеток эпителия желез и стромы к аберрантной экспрессии генов, кодирующих основные пути локального метаболизма витамина D. Нарушение интерфейса "VDR-25(ОН)D" меняет активность транскрипционных с усиленной поляризацией наивных T-лимфоцитов со сдвигом баланса Th1/Th2 в сторону Th1-ответа, подавлением активности Treg-клеток. Полагаем, что интегральное влияние витамина D и VDR на локальный иммунитет эндометрия должно стать предметом дальнейших исследований.

Заключение

Полученные данные позволяют утверждать о формировании фенотипически неоднородных при единой нозологической форме бесплодия (необъяснимого генеза и ассоциированным с ХЭ, ТПБ, НГЭ, "тонким" эндометрием) молекулярных сигнатур эндометрия.

Выделены молекулярно-адаптивные фенотипы эндометрия: пролиферативный, диспластический, с нарушенным иммунным статусом, хроническое воспаление (ХЭ).

Результаты наших исследований расширяют представления об имплантации как о сложной молекулярной системе коммуникаций, координируемой эндокринными, паракринными и иммунорегуляторными факторами. Выявлено, что "несинфазность" эндометрия "рецептивному" статусу при аномальных в период "окна имплантации" параметрах иммунного микроокружения сопровождается молекулярными и клеточными дефектами.

ЛИТЕРАТУРА

1. Whitby S., Salamonsen L.A., Evans J. The endometrial polarity paradox: differential regulation of polarity within secretory-phase human endometrium // Endocrinology. 2018. Vol. 159, N 1. P. 506-518. DOI: https://doi.org/10.1210/en.2016-1877

2. Дюжева Е.В., Коган Е.А., Калинина Е.А. Принципы индивидуальной гормональной подготовки эндометрия у пациенток с неэффективными попытками ЭКО // Акушерство и гинекология. 2011. Т. 7, № 2. С. 39-45.

3. Толибова Г.Х., Траль Т.Г., Клещев М.А. и др. Эндометриальная дисфункция: алгоритм гистологического и иммуногистохимического исследования // Журнал акушерства и женских болезней. 2015. Т. 64, № 4. С. 69-77.

4. Радзинский В.Е., Оразов М.Р., Токтар Л.Р. и др. Эффект "разбросанных пазлов": имплантационные нарушения при хроническом эндометрите // Гинекология. 2020. Т. 22, № 6. С. 93-100.

5. Bashiri A., Halper K.I., Orvieto R. Recurrent Implantation Failure-update overview on etiology, diagnosis, treatment and future directions // Reprod. Biol. Endocrinol. 2018. Vol. 16, N 1. P. 121. DOI: https://doi.org/10.1186/s12958-018-0414-2

6. Lessey B.A. Assessment of endometrial receptivity // Fertil. Steril. 2011. Vol. 96, N 3. P. 522-529. DOI: https://doi.org/10.1016/j.fertnstert.2011.07.1095

7. Ниаури Д.А., Гзгзян А.М., Кветной И.М., Коган И.Ю. Иммуногистохимическая характеристика рецептивности эндометрия в циклах ЭКО // Акушерство и гинекология. 2014. № 9. С. 44-50.

8. Михалева Л.М., Болтовская М.Н., Михалев С.А. и др. Клинико-морфологические аспекты эндометриальной дисфункции, обусловленной хроническим эндометритом // Архив патологии. 2017. T. 79, № 6. С. 22-29. DOI: https://doi.org/10.17116/patol201779622-29

9. Таболова В.К., Корнеева И.Е., Донников А.Е. и др. Профиль локальной экспрессии генов ростовых факторов и цитокинов в эндометрии периода "имплантационного окна" при хроническом эндометрите // Акушерство и гинекология. 2014. № 12. С. 74-78.

10. Raphael I., Nalawade S., Eagar T.N. et al. T cell subsets and their signature cytokines in autoimmune and inflammatory diseases // Cytokine. 2016. Vol. 74. P. 5-17. DOI: https://doi.org/10.1016/j.cyto.2014.09.011

11. Ticconi C., Pietropolli A., Di Simone N. et al. Endometrial immune dysfunction in recurrent pregnancy loss // Int. J. Mol. Sci. 2019. Vol. 20, N 21. Abstr. 5332. DOI: https://doi.org/10.3390/ijms20215332

12. Nandi A., Sinha N., Ong E. et al. Is there a role for vitamin D in human reproduction? // Horm. Mol. Biol. Clin. Investig. 2016. Vol. 25. N 1. P. 15-28. DOI: https://doi.org/10.1515/hmbci-2015-0051

13. Evans K.N., Nguyen L., Chan J. et al. Effects of 25-hydroxyvitamin D3 and 1,25-dihydroxyvitamin D3 on cytokine production by human decidual cells // Biol. Reprod. 2006. Vol. 75, N 6. P. 816-822. DOI: https://doi.org/10.1095/biolreprod.106.054056

14. White J.H. Vitamin D signalling, infectious diseases and regulation of innate immunity // Infect. Immun. 2008. Vol. 76, N 9. P. 3837-3843. DOI: https://doi.org/10.1128/IAI.00353-08

15. Dorostghoal M., Ghaffari H.O., Marmazi F., Keikhah N. Overexpression of endometrial estrogen receptor-alpha in the window of implantation in women with unexplained infertility // Int. J. Fertil. Steril. 2018. Vol. 12, N 1. P. 37-42. DOI: https://doi.org/10.22074/ijfs.2018.5118

16. Dabrowski F., Grzechocinska B., Wielgos M. The role of vitamin D in reproductive health - a Trojan horse or the golden fleece? // Nutrients. 2015. Vol. 7, N 6. P. 4139-4153.

17. Cyprian F., Lefkou E., Varoudi K., Girardi G. Immunomodulatory effects of vitamin D in pregnancy and beyond // Front. Immunol. 2019. Vol. 10. Abstr. 2739.

18. Altmae S., Koel M., Vosa U. et al. Meta-signature of human endometrial receptivity: a meta-analysis and validation study of transcriptomic biomarkers // Sci. Rep. 2017. Vol. 7, N 1. Article ID 10077. DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-017-10098-3

19. Yilmaz N.K., Kara M., Hancerliogullari N. et al. Analysis of two different luteal phase support regimes and evaluation of in vitro fertilization-intra cytoplasmic sperm injection outcomes // Turk. J. Obstet. Gynecol. 2018. Vol. 15, N 4. P. 217-221. DOI: https://doi.org/10.4274/tjod.73603

20. Deshmukh H., Way S.S. Immunological basis for recurrent fetal loss and pregnancy complications // Annu. Rev. Pathol. 2019. Vol. 14. P. 185-210. DOI: https://doi.org/10.1146/annurev-pathmechdis-012418-012743

21. Казачков Е.Л., Казачкова Э.А., Воропаева Е.Е. и др. Морфофункциональные характеристики нарушения восприимчивости эндометрия при хроническом эндометрите // Архив патологии. 2014. Т. 76, № 3. С. 53-58.

22. Пальцев М.А., Айламазян Э.К., Кветной И.М. Молекулярные механизмы заболеваний репродуктивной системы. Санкт-Петербург : Эко-вектор, 2017. 256 с.

23. Abdullah U.H., Lalani S., Syed F. et al. Association of Vitamin D with outcome after intra cytoplasmic sperm injection // J. Matern. Fetal Neonatal Med. 2017. Vol. 30, N 1. P. 117-120. DOI: https://doi.org/10.3109/14767058.2016.1163680

24. Ikemoto Y., Kuroda K., Nakagawa K. et al. Vitamin D regulates maternal T-helper cytokine production in infertile women // Nutrients. 2018. Vol. 10. Abstr. 902. DOI: https://doi.org/10.3390/nu10070902

25. Гришкина А.А., Чистякова Г.Н., Ремизова И.И., Мелкозерова О.А. Рецептивность эндометрия и экспрессия факторов апоптоза и пролиферации в эндометрии женщин с гиперплазией и бесплодием // Вестник Волгоградского государственного медицинского университета. 2019. № 4 (72). С. 37-39.

26. Ishida M., Takebayashi A., Kimura F. et al. Induction of the epithelial-mesenchymal transition in the endometrium by chronic endometritis in infertile patients // PLoS One. 2021. Vol. 16. Article ID e0249775. DOI: https://doi.org/10.1371/journal.pone.0249775

27. Hviid Saxtorph M., Persson G., Hallager T. et al. Are different markers of endometrial receptivity telling us different things about endometrial function? // Am. J. Reprod. Immunol. 2020. Vol. 84, N 6. Article ID e13323. DOI: https://doi.org/10.1111/aji.13323

28. Cicinelli E., Vitagliano A., Loizzi V. et al. Altered gene expression encoding cytochines, grow factors and cell cycle regulators in the endometrium of women with chronic endometritis // Diagnostics (Basel). 2021. Vol. 11, N 3. Abstr. 471. DOI: https://doi.org/10.3390/diagnostics11030471

29. Salama S.A., Kamel M.W., Diaz-Arrastia C.R. et al. Effect of tumor necrosis factor-alpha on estrogen metabolism and endometrial cells: potential physiological and pathological relevance // J. Clin. Endocrinol. Metab. 2009. Vol. 94. P. 285-293. DOI: https://doi.org/10.1210/jc.2008-1389

30. Kitaya K., Takeuchi T., Mizuta S. et al. Endometritis: new time, new concepts // Fertil. Steril. 2018. Vol. 110, N 3. P. 344-350. DOI: https://doi.org/10.1016/j.fertnstert.2018.04.012

31. Chen L., Eapen M.S., Zosky G.R. Vitamin D both facilitates and attenuates the cellular response to lipopolysaccharide // Sci. Rep. 2017. Vol. 7. Article ID 45172.

32. Ota K., Dambaeva S., Han A.R. et al. Vitamin D deficiency may be a risk factor for recurrent pregnancy losses by increasing cellular immunity and autoimmunity // Hum. Reprod. 2014. Vol. 29. P. 208-219.

Материалы данного сайта распространяются на условиях лицензии Creative Commons Attribution 4.0 International License («Атрибуция - Всемирная»)