Новые возможности ранней предикции предраковых и раковых заболеваний шейки матки: стратификация рисков на основе анализа метилирования генов

• Андреев Александр Олегович
• Байрамова Гюльдана Рауфовна
• Зарецкий Андрей Ростиславович
• Ребриков Денис Владимирович
• Баранов Игорь Иванович

Резюме

Рак шейки матки (РШМ) остается одной из актуальных проблем мирового здравоохранения. На сегодняшний день пристальное внимание уделяется организации проведения скрининга на РШМ и повышению уровня его предиктивной эффективности. Так, учитывая ограниченные возможности уже известных скрининговых методов, таких как тестирование на ДНК вируса папилломы человека и цитологическое исследование, многие исследователи изучают перспективы разработки и внедрения в клиническую практику новых диагностических методов, которые могли бы служить дополнением или, возможно, достойной альтернативой общепринятым методам скрининга на РШМ. Одним из таких методов может стать анализ метилирования ДНК определенных генов, модификация которых наиболее характерна для злокачественных новообразований шейки матки. На примере многих исследований было показано, что выявление аномального метилирования различных генов положительно коррелировало с риском развития не только РШМ, но и предраковых поражений шейки матки. В данной статье приводится накопленный в мире опыт применения анализа гиперметилирования различных панелей генов на предмет определения рисков развития рака шейки матки, плоскоклеточного интраэпителиального поражения тяжелой (HSIL) и легкой (LSIL) степени.

Ключевые слова:плоскоклеточные интраэпителиальные поражения; эпигенетические изменения; метилирование ДНК

На сегодняшний день рак шейки матки (РШМ) остается одним из наиболее распространенных онкологических заболеваний среди женщин репродуктивного возраста. Тенденции последних лет демонстрируют, что, несмотря на внедрение программы скрининга во многих развитых странах и проведение крупных многоцентровых исследований, посвященных поискам новых методов лечения и ранней диагностики патологии шейки матки, заболеваемость и смертность от РШМ с каждым годом продолжают расти [1-3].

Рак шейки матки - один из немногих видов рака, для которого существуют рекомендации по проведению скрининга среди населения. Скрининг на РШМ обладает высокой эффективностью в силу длительного периода предраковых заболеваний, возможности эффективного их лечения и наличия достаточно чувствительных и специфичных методов диагностики. В настоящее время многие исследователи склоняются к выводу о том, что первичное проведение тестирования на ДНК вируса папилломы человека (ВПЧ) является более предпочтительным методом скрининга на РШМ по сравнению с цитологическим исследованием ввиду его более высокой чувствительности и значимой отрицательной прогностической ценностью в отношении развития плоскоклеточных интраэпителиальных поражений шейки матки тяжелой (HSIL - high grade squamous intraepithelial lesions) и легкой (LSIL - low grade squamous intraepithelial lesions) степени [4, 5]. Вместе с тем в ряде случаев наблюдается продуктивная фаза ВПЧ-инфекции, при которой происходит продуцирование новых вирионов без встраивания ДНК вируса в геном хозяина, что снижает специфичность тестирования на ДНК ВПЧ в среднем на 3-5% по сравнению с цитологическим методом исследования [6]. Таким образом, становится очевидной необходимость поиска новых методов ранней диагностики поражений шейки матки, которые могли бы дополнить уже использующийся арсенал методов скрининга на РШМ.

Как известно, аномальное метилирование промоторов генов - супрессоров опухолей тесно взаимосвязано с возникновением и прогрессией онкологических заболеваний [7-9]. Метилирование ДНК - модификация молекулы ДНК без изменения самой нуклеотидной последовательности ДНК, которая заключается в присоединении метильной группы к цитозину в составе CpG-динуклеотида в позиции С5 цитозинового кольца. У человека физиологически метилировано около 1% геномной ДНК. Недавно проведенные исследования, включавшие в себя широкую панель анализируемых генов, показали, что метилирование ДНК - один из наиболее распространенных молекулярных механизмов, ассоциированных с развитием РШМ [10-13]. В настоящее время при диагностировании раковых заболеваний гиперметилирование рассматриваемых промоторных областей обнаруживается практически в каждом типе новообразований человека.

Следует обратить внимание также на то, что метилирование цитозина может влиять на онкогенность не только посредством эпигенетического "молчания" генов (см. рисунок). Это происходит потому, что 5-метилцитозин сам по себе является мутагенным за счет способности подвергаться спонтанному гидролитическому дезаминированию, вызывая переходы нуклеотидов ДНК. Кроме того, наличие метильной группы у динуклеотидов CpG в кодирующей области гена сильно увеличивает скорость, с которой мутации индуцируются ультрафиолетовым светом во время развития раковых заболеваний, например рака кожи [14, 15].

Таким образом, становится очевидной связь между исследованием статуса метилирования генов и возникновением онкологических заболеваний. Однако до сих пор международное сообщество не пришло к четкому выводу, имеют ли эти технологии реальное практическое применение, поскольку существует определенная вероятность компрометации результатов анализа ввиду того, что часть изменений метилирования может наблюдаться и в нормальных эпителиальных клетках и быть ассоциирована с физиологическими процессами старения или системной воспалительной реакцией организма. Важно понимать, что анализ метилирования определяет не вероятность наличия злокачественных новообразований, а риск их развития.

Канцерогенез шейки матки обусловлен действием вирусных онкопротеинов Е6 и Е7. Их транскрипция и продуктивный жизненный цикл ВПЧ в дифференцированном эпителии зависят от взаимодействия со множественными клеточными белками и сложного эпигенетического ремоделирования вирусного хроматина, включая как модификации гистонов, так и метилирование ДНК [10]. Функциональная значимость опосредованного метилированием эпигенетического "молчания" генов в развитии РШМ была продемонстрирована для многих известных в настоящее время мишеней метилирования. Так, согласно данным многих источников, метилирование ДНК определенных генов (таких как CADM1, ZSCAN1, ST6GALNAC5, ANKRD18CP, CDH6, GFRA1, GATA4, KCNIP4, LHX8, FAM19A4) встречалось в 70-100% случаев РШМ и в 30-80% случаев HSIL [10, 13, 16]. Несмотря на то что панель генов, гиперметилирование которых характерно для РШМ, включает в себя более 30 потенциальных маркеров, большинство исследователей пришли к заключению, что наиболее целесообразно смотреть лишь определенный узкий спектр генов, обладающих максимальным процентом диагностической эффективности. К одним из наиболее известных и авторитетных работ в этой области относится исследование F.J. Vink и соавт. (2019), в котором были изучены более 500 образцов, полученных от пациенток с РШМ разных гистотипов, включающих в себя также ВПЧ-негативную группу. Полученные результаты продемонстрировали 98,3% случаев положительного метилирования набора генов FAM19A4/miR124-2 [17]. При этом следует отметить, что процент положительного метилирования не зависел от стадии РШМ и ВПЧ-статуса. Аналогичный результат показало и другое исследование - L.M.A. De Strooper и соавт. (2018), в котором при идентичных условиях, но при меньшем размере выборки показатель аномального метилирования FAM19A4/miR124-2 превышал 90% [18].

В последние годы публикуется все больше работ, посвященных метилированию FAM19A4. Недавние исследования показали, что метилирование именно FAM19A4 имеет тесную связь с раком шейки матки и является наиболее перспективным его биомаркером. Разные авторы сообщали об аномальном уровне метилирования гена FAM19A4 при РШМ, который составляет от 79 до 94% [15, 19, 20].

Несмотря на доказанную эффективность анализа метилирования FAM19A4 в образцах РШМ, возникает закономерный вопрос о целесообразности применения данного метода исследования в когортах пациентов с риском развития HSIL и LSIL. В настоящее время еще не накоплено достаточное количество данных, позволяющих однозначно сделать вывод о прогностической и диагностической эффективности анализа метилирования в отношении HSIL и LSIL, однако недавно проведенные исследования демонстрируют положительные тенденции в отношении профилактики предраковых и доброкачественных поражений шейки матки. Так, в исследовании Q. Bu и соавт. (2018) на примере 215 образцов, полученных в результате проведенной прицельной биопсии шейки матки (из которых в 61 случае гистологически подтвердился РШМ, в 57 случаях - HSIL, 31 случае - LSIL, в 66 случаях атипических клеток не было найдено), гиперметилирование FAM19A4 было выявлено в 93,44% образцов с РШМ, 56,14% образцов с HSIL, 35,48% образцов с LSIL и в 10,61% случаев, в при которых не было диагностировано поражение шейки матки (см. таблицу) [19].

Эти данные согласуются с результатами другого исследования, проведенного S.F. Wang и соавт. (2019). Аномальный уровень метилирования FAM19A4 наблюдался в 7,69% здоровых образцов шейки матки, 34,62% случаев LSIL, 55,56% случаев HSIL и 95,83% РШМ [20]. Показательно, что в обоих исследованиях прослеживается четкая зависимость уровня гиперметилирования FAM19A4 от степени поражения шейки матки.

Однако, несмотря на высокую эффективность метода определения метилирования FAM19A4, добавление в изучаемую панель miR124-2 большинством исследователей считается необходимым ввиду возможного исключения фактора ложного получения результата гиперметилирования вследствие потенциальной коморбидности в виде сопутствующего инфекционного процесса. miR124-2 - это микроРНК, представляющие собой семейство малых некодирующих РНК, которые снижают уровень экспрессии генов, кодирующих белок, путем спаривания с комплементарными последовательностями нуклеотидов мРНК-мишени. Уровень микроРНК может повышаться или понижаться при раке, что связано с генетическими и эпигенетическими изменениями [21]. Существуют исследования, показывающие, что микроРНК изменяет уровень экспрессии генов-супрессоров опухолей в интегрированных с ВПЧ клетках рака шейки матки [22]. Сообщалось также и об измененных профилях экспрессии микроРНК при РШМ [32, 24]. Впервые о метилировании miR124 при раковых заболеваниях было показано в работе А. Lujambio и соавт. на примерах рака толстой кишки, легких и молочной железы [25]. Впоследствии многие авторы предпринимали попытки найти связь метилирования miR124 с поражениями шейки матки. Так, в одной из первых исследовательских работ в этой области S.M. Wilting и соавт. (2010) изучали статус метилирования всех 3 геномных локусов, кодирующих miR124, расположенных на хромосомах 8p23.1 (miR124-1), 8q12.3 (miR124-2) и 20q13.33 (miR124-3). Далее авторы сравнили результаты метилирования всех 3 вариантов miR124. Для miR124-1 данные оказались не столь показательными: 27,8% гиперметилирования для CIN I, 46,3% - для CIN III и 82,8% - для РШМ. Слишком частый процент выявления аномального метилирования при поражениях шейки матки легкой степени и отсутствие статистически достоверной разницы между частотой выявления в CIN I и CIN III ставит под сомнение возможность использования miR124-1 в будущих диагностических панелях. Для miR124-3 результаты свидетельствовали о крайне низкой эффективности его применения: 11,1% для CIN I, 9,8% - для CIN III и 72,4% - для РШМ. Внимания заслуживали данные miR124-2, согласно которым гиперметилирование выявлялось в 5,6% случаев CIN I, 19,5% случаев CIN III и 86,2% случаев РШМ. Однако наиболее статистически достоверной оказалась комбинированная система оценки метилирования miR124-1/miR124-2, при которой отсутствовали аномальные результаты метилирования при отсутствии поражений шейки матки; 30,6% случаев гиперметилирования выявлялось при CIN I; 58,5% - при CIN III и 93,1% - при РШМ (p<0,001) [26]. При этом необходимо учитывать, что в настоящее время известно множество микроРНК, которые потенциально являются биомаркерами, ассоциированными с канцерогенезом шейки матки. Одно из недавно проведенных исследований показало, что определение метилирования miR-21, miR-27a, miR-34, miR-34a, miR-146a, miR-155, miR-196a, miR-203 и miR-221 может быть не менее эффективным, чем анализ miR124-2 [27]. Таким образом, в ближайшее время вполне возможно появление новых исследований, демонстрирующих лучшую диагностическую эффективность различных микроРНК по сравнению с miR124-2.

Если обратиться к статистическим показателям эффективности методов диагностики, то существуют убедительные данные, свидетельствующие о высоких уровнях чувствительности и специфичности анализа метилирования FAM19A4/miR124-2, соотносимые с жидкостной цитологией и тестированием на ДНК ВПЧ. Так, сообщается, что комбинированная чувствительность анализа метилирования FAM19A4/miR124-2 к раку шейки матки составила 95% (от 88 до 100%, по данным разных источников), для CIN III - 77% (от 71 до 82%), для CIN II - варьировала от 33,3 до 61,1% [6]. Общая специфичность FAM19A4/miR124-2 составляет 78,3%. Отрицательная прогностическая ценность достигла уровня 99,9% для рака шейки матки, 96,9% для ≥CIN III и 93,0% для ≥CIN II. При этом положительная прогностическая ценность составила 28,3% для ≥CIN III и 36,7% для ≥CIN II.

Заключение

По данным базы PubMed, за период с 2015 по 2023 г. опубликовано всего 22 работы по теме метилирования FAM19A4/mir124-2, ввиду чего становится очевидной научная перспектива дальнейших исследований по этой теме. При этом, несмотря на приведенные убедительные данные об эффективности использования тестов на метилирование ДНК, в будущем необходимо найти способ избегать компрометации результатов исследования вследствие возможного обнаружения физиологически метилированных форм ДНК.

Таким образом, анализ определения аномального метилирования FAM19A4/miR124-2 может служить не только новым эффективным дополнением к уже имеющимся скрининговым методам, а возможно, и будущей достойной альтернативой в проведении скрининга на РШМ.

ЛИТЕРАТУРА

1. Каприн А.Д. Злокачественные новообразования в России в 2020 году (заболеваемость и смертность) / под ред. А.Д. Каприна, В.В. Старинского, А.О. Шахзадовой. Москва : МНИОИ им. П.А. Герцена - филиал ФГБУ "НМИЦ радиологии" Минздрава России, 2021. 252 с. ил.

2. WHO guideline for screening and treatment of cervical pre-cancer lesions for cervical cancer prevention, second edition. World Health Organization, 2021.

3. Цервикальная интраэпителиальная неоплазия, эрозия и эктропион шейки матки : клинические рекомендации. Российское общество акушеров-гинекологов, 2020.

4. Байрамова Г.Р., Прилепская В.Н., Смольникова В.Ю., Юренева С.В. и др. ВПЧ-ассоциированный цервицит: диагностика, лечение и профилактика. Учебное пособие. Москва : ИД Третьяковъ, 2022. 90 с.

5. Inturrisi F., Bogaards J.A., Heideman D.A.M., Meijer C.J.L.M., Berkhof J. Risk of cervical intraepithelial neoplasia grade 3 or worse in HPV-positive women with normal cytology and five-year type concordance: a randomized comparison // Cancer Epidemiol. Biomarkers Prev. 2021. Vol. 30, N 3. P. 485-491. DOI: https://doi.org/10.1158/1055-9965

6. Bonde J., Floore A., Ejegod D., Vink F.J., Hesselink A., van de Ven P.M. et al. Methylation markers FAM19A4 and miR124-2 as triage strategy for primary human papillomavirus screen positive women: a large European multicenter study // Int. J. Cancer. 2021. Vol. 148, N 2. P. 396-405. DOI: https://doi.org/10.1002/ijc.33320 Epub 2020 Oct 21. PMID: 32997803; PMCID: PMC7756277.

7. Hampl M., Hesselink A.T., Meijer C.J.L.M., Denecke A., Einhorn I., Reinecke-Luethge A. et al.; Members of the German Study Group of Colposcopy (SGK). Evaluation of FAM19A4/miR124-2 methylation performance in the management of CIN3 diagnosed pregnant women // Int. J. Cancer. 2022. Vol. 151, N 9. P. 1578-1585. DOI: https://doi.org/10.1002/ijc.34153 Epub 2022 Jun 20. PMID: 35666529.

8. Hillyar C.R., Kanabar S.S., Pufal K.R., Lawson A.W., Saw Hee J.L., Rallis K.S. et al. A systematic review and meta-analysis of the diagnostic effectiveness of human papillomavirus methylation biomarkers for detection of cervical cancer // Epigenomics. 2022. Vol. 14, N 18. P. 1055-1072. DOI: https://doi.org/10.2217/epi-2022-0160 Epub 2022 Sep 28. PMID: 36169190.

9. Zhang L., Tan W., Yang H., Zhang S., Dai Y. Detection of host cell Gene/HPV DNA methylation markers: a promising triage approach for cervical cancer // Front. Oncol. 2022. Vol. 12. Article ID 831949. DOI: https://doi.org/10.3389/fonc.2022.831949 PMID: 35402283; PMCID: PMC8990922.

10. Kremer W.W., Steenbergen R., Heideman D., Kenter G.G., Meijer C. The use of host cell DNA methylation analysis in the detection and management of women with advanced cervical intraepithelial neoplasia: a review // BJOG. 2021. Vol. 128, N 3. P. 504-514. DOI: https://doi.org/10.1111/1471-0528.16395 Epub 2020 Aug 9. PMID: 32619334; PMCID: PMC7818489.

11. Jones P.A., Baylin S.B. The fundamental role of epigenetic events in cancer // Nat. Rev. Genet. 2002. Vol. 3, N 6. P. 415-428. DOI: https://doi.org/10.1038/nrg816 PMID: 12042769.

12. Herman J.G. et al. Incidence and functional consequences of hMLH1 promoter hypermethylation in colorectal carcinoma // Proc. Natl Acad. Sci. USA. 1998. Vol. 95. P. 6870-6875.

13. El Aliani A., El-Abid H., El Mallali Y., Attaleb M., Ennaji M.M., El Mzibri M. Association between gene promoter methylation and cervical cancer development: global distribution and a meta-analysis // Cancer Epidemiol. Biomarkers Prev. 2021. Vol. 30, N 3. P. 450-459. DOI: https://doi.org/10.1158/1055-9965.epi-20-0833 Epub 2021 Jan 13. PMID: 33441308.

14. Pfeifer G.P., Tang M., Denissenko M.F. Mutation hotspots and DNA methylation // Curr. Top. Microbiol. Immunol. 2000. Vol. 249. P. 1-19.

15. Yoon J.H. et al. Methylated CpG dinucleotides are the preferential targets for G-to-T transversion mutations induced by benzo[a]pyrene diol epoxide in mammalian cells: similarities with the p53 mutation spectrum in smoking-associated lung cancers // Cancer Res. 2001. Vol. 61. P. 7110-7117.

16. Kong L., Wang L., Wang Z., Xiao X., You Y., Wu H. et al. DNA methylation for cervical cancer screening: a training set in China // Clin. Epigenetics. 2020. Vol. 12, N 1. P. 91. DOI: https://doi.org/10.1186/s13148-020-00885-7 PMID: 32576279; PMCID: PMC7310541.

17. Vink F.J., Meijer C.J.L.M., Clifford G.M., Poljak M., Oštrbenk A., Petry K.U. et al. FAM19A4/miR124-2 methylation in invasive cervical cancer: a retrospective cross-sectional worldwide study // Int. J. Cancer. 2020. Vol. 147, N 4. P. 1215-1221. DOI: https://doi.org/10.1002/ijc.32614 Epub 2019 Sep 9. PMID: 31390052; PMCID: PMC7383900.

18. De Strooper L.M.A., Berkhof J., Steenbergen R.D.M., Lissenberg-Witte B.I., Snijders P.J.F., Meijer C. et al. Cervical cancer risk in HPV-positive women after a negative FAM19A4/mir124-2 methylation test: a post hoc analysis in the POBASCAM trial with 14 year follow-up // Int. J. Cancer. 2018. Vol. 143. P. 1541-1548.

19. Bu Q., Wang S., Ma J., Zhou X., Hu G., Deng H. et al. The clinical significance of FAM19A4 methylation in high-risk HPV-positive cervical samples for the detection of cervical (pre)cancer in Chinese women // BMC Cancer. 2018. Vol. 18, N 1. P. 1182. DOI: https://doi.org/10.1186/s12885-018-4877-5 PMID: 30486875; PMCID: PMC6263049.

20. Wang S.F., Bu Q.W., Zhang L., Ma J.W., Heng Y., Luo J.Q. et al. [Detection and analysis of FAM19A4 promoter methylation in cervical exfoliated cells] // Zhonghua Yi Xue Za Zhi. 2019. Vol. 99, N 25. P. 1963-1967. DOI: https://doi.org/10.3760/cma.j.issn.0376-2491.2019.25.012 PMID: 31269601. (in Chinese)

21. Wang F., Liu M., Li X., Tang H. MiR-214 reduces cell survival and enhances cisplatin-induced cytotoxicity via down-regulation of Bcl2l2 in cervical cancer cells // FEBS Lett. 2013. Vol. 587, N 5. P. 488-495. DOI: https://doi.org/10.1016/j.febslet.2013.01.016 Epub 2013 Jan 18. PMID: 23337879.

22. 21. Henken F.E., Wilting S.M., Overmeer R.M., van Rietschoten J.G., Nygren A.O., Errami A. et al. Sequential gene promoter methylation during HPV-induced cervical carcinogenesis // Br. J. Cancer. 2007. Vol. 97. P. 1457-1464. DOI: https://doi.org/10.1038/sj.bjc.6604055

23. Widschwendter A., Muller H.M., Fiegl H., Ivarsson L., Wiedemair A., Muller-Holzner E. et al. DNA methylation in serum and tumors of cervical cancer patients // Clin. Cancer Res. 2004. Vol. 10. P. 565-571. DOI: https://doi.org/10.1158/1078-0432.CCR-0825-03

24. Overmeer R.M., Henken F.E., Bierkens M., Wilting S.M., Timmerman I., Meijer C.J. et al. Repression of MAL tumor suppressor activity by promoter methylation during cervical carcinogenesis // J. Pathol. 2009. Vol. 219, N 3. P. 327-336.

25. Lujambio A., Ropero S., Ballestar E., Fraga M.F., Cerrato C., Setien F. et al. Genetic unmasking of an epigenetically silenced microRNA in human cancer cells // Cancer Res. 2007. Vol. 67. P. 1424-1429. DOI: https://doi.org/10.1158/0008-5472.CAN-06-4218

26. Wilting S.M., van Boerdonk R.A., Henken F.E., Meijer C.J., Diosdado B., Meijer G.A. et al. Methylation-mediated silencing and tumour suppressive function of hsa-miR-124 in cervical cancer // Mol. Cancer. 2010. Vol. 9. P. 167. DOI: https://doi.org/10.1186/1476-4598-9-167 PMID: 20579385; PMCID: PMC2917428.

27. Shen S., Zhang S., Liu P., Wang J., Du H. Potential role of microRNAs in the treatment and diagnosis of cervical cancer // Cancer Genet. 2020. Vol. 248-249. P. 25-30. DOI: https://doi.org/10.1016/j.cancergen.2020.09.003

Материалы данного сайта распространяются на условиях лицензии Creative Commons Attribution 4.0 International License («Атрибуция - Всемирная»)