Распространенность бесплодия во всем мире не имеет тенденции к снижению и в настоящее время достигает 12-15%. Вместе с тем ежегодно растет число супружеских пар, прибегающих к лечению бесплодия с помощью вспомогательных репродуктивных технологий (ВРТ) [1]. Эндометриоз с полным основанием рассматривается в качестве одной из ведущих причин нарушения репродуктивной функции у женщин [2]. По статистике, 30-50% женщин с эндометриозом бесплодны, а у 25-50% женщин с бесплодием определяют эндометриоз [3]. По данным К.В. Краснопольской (2019), у каждой 3-й пациентки, обратившейся в центр ВРТ для проведения экстракорпорального оплодотворения (ЭКО), выявляется наружный генитальный эндометриоз (НГЭ) [4].
Согласно современным представлениям, можно выделить 4 значимых этиологических фактора формирования бесплодия, обусловленного эндометриозом: трубно-перитонеальный, овариальный, эмбриональный и эндометриальный [5]. На сегодняшний день точно не известно, какой из этих факторов вносит наибольший вклад в развитие эндометриоз-ассоциированного бесплодия, по поводу чего ведутся активные научные дебаты [6, 7]. Сочетание эндометриоза и бесплодия является "проблемой внутри проблемы", далекой от окончательного решения, а большое количество версий и контраверсий диктует необходимость тщательного изучения дискуссионных аспектов данной проблемы. Эуто-пический эндометрий при эндометриоз-ассоциированном бесплодии не так давно стал предметом внимания исследователей, поэтому его роль в неудачах преодоления бесплодия четко не определена и представляет особый интерес для изучения.
Цель исследования - расширить представления о патогенезе бесплодия у женщин с НГЭ. Дать морфофункциональную характеристику эндометрия у пациенток с бесплодием, ассоциированным с НГЭ, имеющих неудачи ЭКО в анамнезе.
Материал и методы
Исследование проведено в 2020-2021 гг. на клинической базе кафедры акушерства и гинекологии с курсом перинатологии Медицинского института ФГАОУ ВО РУДН - в центре репродукции и генетики "Nova Clinic".
Критерии включения: возраст от 19 до 40 лет; морфологически верифицированный НГЭ (МКБ-10: N80.1, 80.3, 80.4), женское бесплодие, неудачи ЭКО (МКБ-10: N97.2). Исследуемую группу составили 12 пациенток с НГЭ и ≥1 неудачных попыток переноса эмбриона (ПЭ) в анамнезе. В качестве морфологического контроля были использованы биоптаты эндометрия фертильных женщин без НГЭ (n=5).
Все пациентки были обследованы согласно приказу Минздрава России от 20 августа 2012 г. № 107н "О порядке использования вспомогательных репродуктивных технологий, противопоказаниях и ограничениях к их применению".
Морфологическое и иммуногистохимическое исследование эутопического эндометрия пациенток, включенных в исследование, проводили на базе Федерального государственного бюджетного научного учреждения "Научно-исследовательский институт морфологии человека".
Каждой женщине была выполнена пайпель-биопсия эндометрия в фазу секреции, в предполагаемое "окно имплантации" - через 5-6 дней после овуляции, зарегистрированной совокупностью методов (определение пика концентрации лютеинизирующего гормона в моче и сыворотке крови, ультразвуковая фолликулометрия). После гистологической проводки в автоматическом гистопроцессоре "Leica ASP 30" полученный материал заливали в парафин на станции "Leica EG 1150" (Германия). Гистологические срезы толщиной 4 мкм окрашивали гематоксилином и эозином в автоматической станции "Leica ST 5010". Микроскопическое исследование выполняли на триокулярном микроскопе "Leica DM LB" (х10) с использованием цифровой камеры "Leica DFC 420" (Германия). В полученных микропрепаратах проводили патоморфологическую оценку фазы и стадии менструального цикла, а также датировку эндометрия по критериям Noyes [8].
Иммуногистохимическое (ИГХ) окрашивание с помощью иммуностейнера "Ventana BenchMark ULTRA IHC/ISH" (США) на парафиновых срезах по стандартной методике с использованием антител к стероидным рецепторам (ER, PR), плазмоцитам (CD138) и NK-клеткам (CD56) было проведено на 11 биоптатах эндометрия женщин изучаемой когорты. Оценку окрашивания к стероидным гормонам проводили в баллах HScore, подсчитанных в 5 полях зрения при увеличении х200 отдельно для эпителия желез и стромы по следующей формуле:
HScore = Σ (Pi × i),
где i - интенсивность окрашивания со значением 1, 2 или 3 (слабая, умеренная или сильная соответственно); Pi - процент окрашенных ядер клеток для каждой интенсивности, варьирующий от 0 до 100%.
За финальное значение принимали среднее арифметическое из 5 полученных результатов для стромы и желез соответственно. Для оценки параметров местного иммунитета (CD138 и CD56) парафиновые срезы после ИГХ-окраски просматривали в световом микроскопе в 3 полях зрения при увеличении микроскопа ×400. Подсчитывали количество положительно окрашенных клеток в каждом поле зрения. В случае незначительного разброса количественных показателей в разных полях зрения определяли среднее арифметическое. Наличие экспрессии CD138 в эндометрии позволяло с большей вероятностью диагностировать хронический эндометрит (ХЭ).
Обработку данных выполняли с использованием электронных таблиц Microsoft Excel и пакета прикладных программ Statistica 10.0, используя методы описательной статистики.
Результаты
Средний возраст пациенток исследуемой группы (n=12), которым была выполнена пайпель-биопсия эндометрия в день предполагаемого "окна имплантации", составил 35,8±4,6 года. Все женщины в анамнезе имели более одной неудачной попытки ПЭ в программах ВРТ. В исследуемой группе частота встречаемости эндометриоза брюшины и односторонней резекции эндометриоидной кисты яичника (ЭКЯ) в анамнезе была одинакова - 41,6%. Двусторонняя резекция ЭКЯ в анамнезе имела место у 16,8% пациенток. Частота первичного и вторичного бесплодия была одинакова - 50%.
Аспирационную биопсию эндометрия в среднем проводили на 20±2-й день менструального цикла, что соответствовало 5-6-му дню после зарегистрированной овуляции. Средняя продолжительность менструального цикла составила 28,5±3,3 дня, продолжительность менструации - 4,5±1 день.
Морфологическое соответствие эндометрия средней стадии секреции, наиболее благоприятной для имплантации, было выявлено лишь у 3 (25%) пациенток, тогда как у остальных 9 (75%) эндометрий не соответствовал этой фазе (у 8 была подтверждена ранняя фаза секреции, у 1 женщины - поздняя). По результатам микроскопического исследования биоптатов эндометрия признаки крупно- и мелкоочагового фиброза стромы были обнаружены в 7 (58,3%) наблюдениях, а лейкоцитарной инфильтрации стромы - у 3 (25%) пациенток, что было расценено как косвенные признаки ХЭ в секреторной фазе менструального цикла. В связи с этим для верификации диагноза проводили ИГХ реакцию с CD138.
Несмотря на косвенные гистологические признаки ХЭ положительное окрашивание CD138 было обнаружено в 2 (18,2%) образцах эндометрия, что было расценено как умеренно выраженный ХЭ. Положительное окрашивание CD56 >30 клеток обнаружено у 8 (72,7%) пациенток, что было интерпретировано как признаки нарушения местного иммунитета эндометрия. Среднее количество окрашенных клеток CD56 в образцах пациенток исследуемой группы составило 34,2±10, что превышало норму (до 30 клеток), тогда так в группе морфологического контроля таких нарушений не выявлено (15,7±11,3). В половине биоптатов выявлено соответствие экспрессии половых стероидов морфологической фазе менструального цикла. При сравнении с группой морфологического контроля у каждой 2-й пациентки с НГЭ при ИГХ-анализе биоптатов эндометрия обнаружено нарушение рецепции к половым стероидам, которое выражалось в значимо более (p<0,05) высокой экспрессии ER (в 2,3 раза; соответственно 19,5 против 8,4%) на фоне более низкой экспрессии PR (в 2,5 раза; соответственно 58 против 23,4%). Важно отметить, что у всех 3 (25%) пациенток с морфологическим соответствием эндометрия средней стадии секреции были выявлены нарушения его рецептивности на основании дефектной экспрессии рецепторов прогестерона и эстрогена.
По совокупности данных морфологического и ИГХ-исследований эутопического эндометрия пролиферативные болезни были выявлены в 3 (27,2%) образцах: у 2 женщин - ХЭ, в 1 наблюдении - полип эндометрия. Учитывая небольшую выборку, однозначно судить об истинной частоте болезней эндометрия на данном этапе не представляется возможным.
Обсуждение
В ряде исследований описаны особые морфологические и функциональные характеристики эндометрия при НГЭ как ключевого фактора неоднократных неудачных попыток ПЭ [6]. Полагают, что в основе имплантационной несостоятельности эндометрия лежат изменения его рецепторного профиля, что приводит к нарушению его восприимчивости к бластоцисте в период "окна имплантации" и детерминирует неблагоприятный исход ПЭ [9].
По совокупности полученных нами данных морфологического и ИГХ-исследований, более чем у половины женщин (66,7%) в эутопическом эндометрии при НГЭ был выявлен ряд таких функциональных особенностей, как смещение "окна имплантации", нарушения местного иммунитета и рецептивности.
При морфологическом исследовании у 75% пациенток эндометрий не соответствовал той фазе менструального цикла, в которой должна происходить имплантация эмбриона (средняя фаза секреции). Обнаруженный факт свидетельствует о смещении "окна имплантации" преимущественно в сторону более позднего "открытия", так как в большинстве биоптатов была датирована ранняя стадия фазы секреции. Более чем в половине наблюдений обнаруживался мелкоочаговый фиброз стромы эндометрия при отсутствии классических признаков ХЭ. Некоторые авторы расценивают этот факт как маркер вирусного инфицирования эндометрия [10]. При дополнительном ИГХ-исследовании с использованием классического маркера синдекана-1 ХЭ был верифицирован у 18,2% пациенток как умеренно выраженный.
Стоит обратить пристальное внимание на местный иммунитет эндометрия. Так, в 72,7% биоптатов пациенток изучаемой когорты была обнаружена выраженная статистически значимая экспрессия CD56 - маркера NK-клеток. Как следует из результатов, местный иммунитет при НГЭ в сочетании с бесплодием значительно страдает, а NK-клетки играют важную роль в иммунном ответе при ХЭ.
Другой, не менее значимой находкой стало нарушение рецепции к половым стероидам, которое наблюдалось у половины пациенток изучаемой когорты. Важно подчеркнуть, что при морфологическом соответствии эндометрия средней стадии секреции у 25% пациенток наблюдалось нарушение его рецептивности, а это выводит на передний план функциональные изменения эутопического эндометрия при эндометриозе. По совокупности морфологической и ИГХ-оценки эутопического эндометрия при НГЭ полученные результаты во многом сопоставимы с результатами работ Г.Х. Толибовой и соавт. (2017), в которых отражено наличие эндометриальной дисфункции при НГЭ в сочетании с бесплодием [11, 12], и это следует учитывать при разработке индивидуальных программ ведения пациенток с неудачами ЭКО и ПЭ.
Заключение
Причиной неудач ПЭ при попытке преодоления бесплодия у женщин, страдающих НГЭ, могут служить нарушения чувствительности стероидных рецепторов и локального иммуногенеза в эутопическом эндометрии, что проявляется смещением "окна имплантации". Об этом свидетельствует значимо более (p<0,05) высокая в сравнении с группой морфологического контроля экспрессия ER (в 2,3 раза) на фоне более низкой экспрессии PR (в 2,5 раза), а также более высокая экспрессия CD56 (в 2,2 раза) и несоответствие эндометрия средней стадии секреции в период "окна имплантации" (75% наблюдений). Полученные данные следует учитывать при разработке индивидуальных программ ведения пациенток с неудачами ЭКО и ПЭ.
Литература
1. Vander Borght, M., Wyns, C. Fertility and infertility: Definition and epidemiology // Clin. Biochem. 2018. Vol. 62. Р. 2-10.
2. Бесплодие и эндометриоз. Версии и контраверсии / под ред. В.Е. Радзинского, М.Р. Оразова. Москва : StatusPraesens, 2019. 208 с.
3. Evans M.B., Decherney A.H. Fertility and endometriosis // Clin. Obstet. Gynecol. 2017. Vol. 60. Р. 497-502.
4. Краснопольская К.В. Лечение бесплодия при эндометриозе: Взгляд репродуктолога. Москва, 2019. С. 28-80.
5. Оразов М.Р., Радзинский В.Е., Хамошина М.Б. и др. Эффективность лечения бесплодия, обусловленного рецидивирующим наружным генитальным эндометриозом // Гинекология. 2019. Т. 21, № 1. С. 38-43.
6. Lessey B.A., Kim J.J. Endometrial Receptivity in Eutopic Endometrium of Women with Endometriosis It is affected, let me show you why // Fertil. Steril. 2017. Vol. 108 (1). Р. 19-27.
7. Miravet-Valenciano J., Ruiz-Alonso M., Gomez E., Garcia-Velasco J.A. Endometrial receptivity in eutopic endometrium in patients with endometriosis: it is not affected, and let me show you why // Fertil. Steril. 2017. Vol. 108. Р. 28-31.
8. Noyes R.W., Herting A., Rock J. Dating the endometrial biopsy // Fertil. Steril. 1950. Vol. 1. Р. 3-25.
9. Оразов М.Р., Хамошина М.Б., Михалева Л.М. и др. Молекулярно-генетические особенности состояния эндометрия при эндометриоз-ассоциированном бесплодии // Трудный пациент. 2020. № 1 (18). С. 23-32.
10. Колмык В.А. Клинико-морфологическая характеристика хронического эндометрита у женщин с отягощенным акушерско-гинекологическим анамнезом: дис. ... канд. мед. наук. 2019.
11. Толибова Г.Х., Траль Т.Г., Ярмолинская М.И., Цыпурдеева А.А. Эндометриальная дисфункция у пациенток с бесплодием, ассоциированным с наружным генитальным эндометриозом // Журнал акушерства и женских болезней. 2017. Т. 66 (S). С. 84-85.
12. Толибова Г.Х., Траль Т.Г., Клещев М.А. и др. Эндометриальная дисфункция: алгоритм гистологического и иммуногистохимического исследования // Журнал акушерства и женских болезней. 2015. Т. 64, № 4. С. 69-77.