Сахарный диабет (СД) относится к числу наиболее распространенных эндокринных заболеваний, и каждые 10-15 лет число больных СД увеличивается в 2 раза. Гестационный сахарный диабет (ГСД) оказывает неблагоприятное влияние на течение беременности, приводя к осложнениям, отрицательно воздействуя на внутриутробное развитие плода и адаптационные возможности новорожденного [1].
Одним из основных осложнений СД во время беременности является диабетическая фетопатия (ДФ) - симптомокомплекс болезней плода, развивающихся в конце раннего и в позднем фетальном периодах в ответ на гипергликемию у матери [2]. Наиболее типичным признаком ДФ является макросомия - увеличение массы тела новорожденного >4000 г при доношенной беременности или превышение 90-го перцентиля массы по таблицам внутриматочного роста плода при недоношенной беременности [3].
В настоящее время доказано, что развитие СД и ГСД является следствием генетической предрасположенности к заболеванию. К возникновению ГСД и СД типа 2 (СД2) причастны полиморфизмы тождественных генов, отвечающих за синтез и секрецию инсулина (INS, KCNJ11, АВСС8, TCF7L2, ND1),связанных с передачей инсулинового сигнала (INSR, IGF2, IRS1), регулирующих углеводный и липидный обмен (PPARG, PPARGC1A, ADRB3, GLUT1, ADIPOQ, FOXC2) и пр. [4].
В современной литературе появляется много исследований, посвященных изучению новых аспектов патогенеза СД2 и ГСД. Так, в работе [5] описан малоизученный подход к этой проблеме. Он основан на понимании 2 различных патогенетических механизмов развития СД2: центрального, связанного со снижением утилизации глюкозы мозгом ("когнитивного" диабета), и периферического, обусловленного уменьшением потребления глюкозы мышечной тканью ("спортивного").
Ученые определили гены, полиморфизм которых становится основой подключения одного из механизмов: 1) ген DRD2 рецептора дофамина, отвечающий за потребление глюкозы мозгом; 2) ген PGClα, ответственный за интенсивность метаболизма в мышечной ткани, и ген ангиотензин-1-превращающего фермента [АПФ, англ. angiotensin-1 converting enzyme (АСЕ)], причастный к периферической гемодинамике.
Нас заинтересовала представленная учеными концепция, и мы решили оценить причастность перечисленных генов к развитию ГСД и диабетической фетопатии. В связи с перечисленным выше, целью нашего исследования стало определение распространенности генотипов по 3 генам (PGC1α, АСЕ и DRD2) среди беременных с ГСД и их детей; выявление причастности полиморфизмов генов к нарушениям углеводного обмена у новорожденных, а также к возникновению ДФ.
Материал и методы
Для решения поставленных цели и задач нами обследованы 107 родильниц, родоразрешенных в 2017-2018 гг. в родильном отделении ГБУЗ "Городская клиническая больница № 29 им. Н.М. Баумана" Департамента здравоохранения г. Москвы, и 107 родившихся у них детей. Все беременные были распределены на 3 группы: 1-ю составили 37 наблюдаемых с инсулинопотребным ГСД; во 2-ю группу вошли 39 пациенток с ГСД, использовавших для лечения только диету; в 3-ю (контрольную) группу включена 31 здоровая беременная без нарушений углеводного обмена.
У всех 107 наблюдаемых в III триместре в сыворотке крови определялись: уровень гликированного гемоглобина (HbA1c), фруктозамина и уровень глюкозы натощак перед родами. Во время родов у 107 рожениц в пуповинной крови оценены: уровень HbA1c и фруктозамина. Все 107 детей были доношенными. У всех новорожденных в плазме определялся уровень фруктозамина.
Всем 107 мамам 1-3-й групп и их детям проведено генотипирование по генам PGC1α, АСЕ и DRD2. Исследование проводили на базе ФГБНУ "Научно-исследовательский институт общей патологии и патофизиологии" (Москва). С этой целью из лейкоцитов периферической крови извлечена и оценена общая геномная ДНК. Генотипирование PGC1α (GLy482Ser, rs8192678, G>A, замена нуклеотида) и DRD2/ANKK1 (TaqIA, rs18000497, нуклеотидные изменения А1-Т и А2-С) проводили методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) в реальном режиме времени на детектирующем амплифика-торе ДТ-322 ("ДНК-технология", Россия) в агарозном геле (SibEnzyme Ltd, Россия) при использовании комплектов реагентов, основанных на принципах флюоресцентной детекции; либо с помощью готовых наборов для анализа экспрессии генов TaqMan® SNP Genotyping Assays. Для выявления инсерционно-делеционного (I/D) полиморфизма I/D в интроне 16 гена ACE применяли гелевую систему визуализации. Показания конечных точек анализировались в соответствии с инструкциями производителя.
Проведен сравнительный анализ исследуемых показателей в 3 группах беременных и их детей. Статистически значимые различия между сравниваемыми группами при нормальном распределении выборки выявляли с применением методов дисперсионного анализа и t-критерия Стьюдента, при ненормальном распределении - его непараметрического аналога (критерия Манна-Уитни). За критический уровень значимости принимали р≤0,05. Использовали программу Statistika 13.
Результаты
Распределение генотипов мам и детей по группам представлено на рис. 1-3. Из данных рис. 1А и 2, а следует, что генотип Gly/Gly по гену PGClα чаще встречался при ГСД (в 1-й группе - у 28,3%, во 2-й - у 51,4%), чем в контрольной группе (у 19,35%). Генотип Т/Т по гену DRD2 обнаружен только у беременных с ГСД (у 26,6 и 8,1% соответственно). В связи с этим можно предположить, что G-и Т-содержащие аллели генов PGClα и DRD2 соответственно могут быть причастны к развитию ГСД. В этом мы планируем убедиться в ходе настоящего исследования. Данные рис. 3А не позволили судить о возможном участии полиморфизма гена АСЕ в возникновении ГСД, однако этот факт будет уточнен далее.
Для изучения генетических механизмов развития ГСД и ДФ нами проведен анализ различных клинико-лабораторных параметров у 76 беременных с ГСД в зависимости от имеющегося генотипа.
Уровень HbAc у беременных с ГСД (I и II группы) варьировал от 4,5 до 7,63%, в среднем составляя 5,43±0,57%, что было достоверно ниже, чем в контрольной группе (5,27±0,55%) при р≤0,05 (3-я группа). Различия в показателях HbA1c между 1-й и 2-й группами были недостоверными (р>0,05). Отмечено влияние на этот параметр полиморфизма 2 генов - PGCla и АСЕ. Так, носители генотипа Gly/Gly гена PGClα (рис. 4А) имели более высокий HbA1c (5,63±0,71%), чем генотипа Gly/Ser (5,27±0,44 при р≤0,05) и Ser/Ser (5,34±0,41 при р>0,05). I-содержащие аллели гена АСЕ (I/I и I/D) также ассоциировались с повышенным HbA1c (5,59±0,63 и 5,45±0,56%) по сравнению с D/D (5,19±0,48% при р≤0,05).
Содержание фруктозамина в плазме у беременных с ГСД (1-я и 2-я группы) варьировало в пределах 1,3-7,41 ммоль/л, в среднем составляя 2,7±0,88 ммоль/л, у здоровых беременных - 2,82±0,64 ммоль/л (3-я группа). Различия этого показателя между 1-3-й группами оказались недостоверными (р>0,05). Минимальным уровень фруктозамина был у носителей генотипа С/С гена DRD2 (2,36±0,45 ммоль/л). У пациенток с генотипами С/Т (2,91±1,17) и Т/Т (3,02±0,62), а также у беременных контрольной группы (2,82±0,64 ммоль/л) этот показатель был достоверно выше (р<0,05). Влияние полиморфизма генов PGC1α и АСЕ на концентрацию фруктозамина в крови у беременных с ГСД не обнаружено.
Также у всех 76 беременных с ГСД (1-я и 2-я группы) нами проанализирован уровень глюкозы натощак перед родами. Было установлено, что он варьировал в интервале 5,1-10 ммоль/л и в среднем составлял 7,19±1,16 ммоль/л. Показатели в 1-й группе (7,52±1,06) были достоверно выше, чем во 2-й (6,85±1,03) при р<0,05. Выявлено влияние полиморфизма гена АСЕ на концентрацию глюкозы: у носителей генотипа I/I (7,46±1,35) она была достоверно выше, чем у пациенток с генотипами I/D (7,02±1,24) и D/D (7,23±0,61) при р≤0,05. Полиморфизм генов PGC1α и DRD2 не был связан с уровнем глюкозы в крови натощак перед родами при ГСД. Следовательно, в ходе проведенного исследования было доказано, что полиморфизмы генов PGC1α, АСЕ и DRD2 причастны к нарушениям углеводородного обмена у беременных с ГСД, однако они не влияют на возникновение того или иного типа ГСД (инсулинопотребного или диетозависимого).
Далее нами был оценен углеводный спектр у новорожденных 1-2-й групп и изучена связь его изменений с полиморфизмом генов у матери. Установлено, что уровень фруктозаминау новорожденных 1-2-й групп в среднем составлял 3,29±1,71 ммоль/л (разброс - 1,72-12,12 ммоль/л) и был максимальным в крови у детей, матери которых были носителями генотипа GLy/GLy гена PGCla (3,35±1,32 ммоль/л) и I/I гена АСЕ (3,9±2,52 ммоль/л), что было достоверно выше, чем в контрольной группе (2,85±0,55 ммоль/л). Отмечены достоверные различия в показателях фруктозамина с носителями генотипов GLy/Ser (3,18±2,46) гена PGCla у матери и D/D (2,6±0,91) гена АСЕ при р≤0,05, а также - Ser/Ser (3,24±0,74) и I/D (3,18±1,18) соответственно, при р>0,05.
Нами проведен анализ полиморфизмов генов PGClα и DRD2 и АСЕ у 107 детей (рис. 1-3Б). Было установлено, что генотипы по гену PGC1α у новорожденных распределялись одинаково в разных группах (см. рис. 1Б). Генотип Т/Т по гену DRD2, причастный к нарушениям обмена у беременных с ГСД (рис. 2Б), чаще встречался среди новорожденных 1-й (у 24,3%) и 2-й (у 15,4%) групп, чем в контрольной группы (у 6,45%). Анализ распределения генотипов по гену АСЕ у детей продемонстрировал: исчезновение D/D из контрольной группы; отсутствие различий между мамами и детьми - в 2-й группе; увеличение частоты распространения генотипа D/D среди новорожденных по сравнению с их матерями (у 37,8 и 13,5%) - в 1-й группе.
Учитывая, что изучаемые нами гены (PGC1α, DRD2 и АСЕ) причастны к нарушениям обмена веществ у беременных, особый интерес представляло изучение влияния полиморфизма данных генов на особенности метаболизма новорожденных.
В ходе проведенного исследования была обнаружена связь между генотипами изучаемых генов у детей и некоторыми параметрами пуповинной крови, а также вероятностью развития диабетической фетопатии. Так, ДФ диагностирована у 24 из 76 (31,6%) детей, рожденных у матерей с ГСД. Было установлено, что генотип Т/Т по гену DRD2 у фетопатов встречается реже (у 8,7%), чем у детей без ДФ (у 25%), выполняя на внутриутробном этапе развития, вероятнее всего, защитную функцию (рис. 4А). Также у детей с ДФ чаще выявлялся генотип D/D по гену АСЕ, чем без ДФ (рис. 4Б).
Следовательно, защитными можно считать I-содержащие аллели (I/I и I/D) гена АСЕ у новорожденных от матерей с ГСД. При анализе распределения генотипов по гену PGC1α установлено, что причастный к развитию ГСД G-содержащий аллель реже выявлялся у детей с ДФ, чем без нее: у 56 и 70% соответственно (рис. 4В). Полиморфизмы исследуемых генов матери (DRD2, АСЕ и PGC1α) не влияли на развитие ДФ у новорожденного.
Оценив ряд показателей пуповинной крови, авторы смогли проанализировать механизмы, посредством которых осуществляется защита метаболизма плода. Так, уровень HbAc у новорожденных 1-2-й групп в среднем составлял 2,56+0,54% (разброс значений - 2,11-4,68%).
Различия в изученных показателях между 1-й и 2-й группами были недостоверными (р>0,05). Установлено, что в пуповинной крови у плодов-носителей генотипа GLy/ GLy был максимально снижен уровень HbA1c (2,44±0,24% ммоль/л) по сравнению с носителями GLy/Ser (2,61±0,68 ммоль/л, при р≤0,05) и носителями Ser/Ser (2,59±0,51, при р≤0,05), а также по сравнению с контрольной группой (2,66±0,20, при р≤0,05). Снижение уровней HbA1c у плодов-носителей диабетогенного генотипа GLy/GLy по гену PGCla можно считать защитным механизмом.
Содержание фруктозамина в пуповинной крови у новорожденных 1-2-й групп в среднем составляло 2,19±0,7 ммоль/л (0,7-5,4 ммоль/л) соответственно, что было достоверно ниже, чем в контрольной группе (2,85±1,5 ммоль/л, при р≤0,05). Было обнаружено, что дети с генотипом I/I имели максимальный уровень фруктозамина (2,41±1,01 ммоль/л) по сравнению с носителями I/D (2,07±0,53 ммоль/л, при р≤0,05) и D/D (2,21±1,54 ммоль/л, при р>0,05). Была установлена прямая корреляция между содержанием фруктозамина в пуповинной крови и плазме беременных с ГСД (r=0,34). Следовательно, полиморфизмы гена АСЕ новорожденного воздействуют на уровень фруктозамин пуповинной крови, в то же время не исключено влияние на этот параметр метаболизма матери.
Обсуждение
Известно, что ключевыми регуляторами обмена углеводов являются рецепторы, находящиеся под воздействием пролифераторов пероксисом (Peroxisome proliferator-activated receptor [PPAR]) [6]. На активность PPAR-белков влияет ко-активатор PGC-1a, кодирующийся геном PPARGC1A (локализован в хромосоме 4 (4p15.1)). Один из PPAR-белков -PGC-1α - запускает экспрессию ряда факторов транскрипции, влияет на активность образования митохондрий, окислительных процессов, содержание мышечных волокон, секрецию инсулина, глюконеогенез, липогенез и хондрогенез [7]. Уровень экспрессии гена PGC1α резко возрастает при длительной физической нагрузке, что приводит к увеличению числа митохондрий в клетках и усилению окисления жирных кислот. Аллель GLy482 гена ассоциирован с проявлением скоростных и силовых качеств, высокой работоспособностью, мышечной и аэробной выносливостью, увеличением числа мышечных волокон и часто встречается в группе стайеров на длинные дистанции [8].
Среди многих вариаций в гене PGC1α особый интерес представляет замена нуклеотида G на A в положении 1444 8-го экзона, которая приводит к замещению глицина на серин в положении 482 белка PGC-1α (GLy482Ser) [9]. Полиморфизм ассоциирован со снижением уровня экспрессии гена PGC1α, уменьшением окислительных процессов и митохондриального биогенеза [6]. В настоящее время доказано, что полиморфизм GLy482Ser связан с инсулинорезистентностью (ИР) и изменением метаболизма липидов [7]. В то же время в более ранних работах показано отсутствие ассоциации между генотипом Ser/Ser и риском возникновения таких заболеваний, как СД [10]. N. Shaat и соавт. [11] убеждены, что полиморфизм GLy482Ser не вызывает развитие ГСД.
В нашем исследовании доказана связь между вариантами генотипов по гену PGC1α и ГСД. Однако, в отличие от большинства перечисленных исследователей, нами при ГСД чаще, чем в контрольной группе (у 19,35%), определялся генотип GLy/GLy (в 1-й группе - у 28,3%, во 2-й - у 51,4%). Поэтому перед нами встал вопрос: почему аллель GLy, связанный с проявлением скоростных и силовых качеств, высокой работоспособностью, мышечной и аэробной выносливостью, в нашей работе чаще встречался при ГСД, а также приводил к нарушению углеводного обмена?
Ответ был найден в исследовании D.M. Davydov, M.K. Nurbekov [5]. Клиницисты доказали, что у физически неактивных лиц, коими являются беременные, с высоким мышечным метаболизмом, обусловленным генетической предрасположенностью к интенсивной или тяжелой физической работе (аллель GLy), отмечается гиперэкспрессия гена в печени и β-клетках, растет уровень глюкозы и возникает СД. Следовательно, у неспортивных беременных с генотипом GLy/GLy повышается риск развития ГСД, во избежание которого им необходима физическая активность.
Также нами выявлено негативное влияние "невостребованной" материнской глюкозы на метаболизм новорожденного. Установлено, что в крови у детей, матери которых являются носителями генотипа GLy/GLy, был максимальным уровень фруктозамина. Полученные результаты подчеркивают важность персонифицированного подхода к ведению ГСД в зависимости от генотипа женщины по гену PGC1α для улучшения исходов беременности.
Ген ACE картирован в локусе 17q23. АПФ является ключевым ферментом в системе ренин-ангиотензин. Его эффекты включают катализацию превращения ангиотензина I в ангиотензин II и инактивацию сосудорасширяющего пептида брадикинина. Ген ACE имеет более 100 аллельных вариантов, из которых наиболее важным является I/D полиморфизм [12]. АСЕ, так же как PGC1α, относится к разряду так называемых спортивных генов, так как снижение артериального давления (АД) у носителей генотипа I/I повышает выносливость [13]. Аллель I часто встречается среди триатлонистов, марафонцев, пловцов и гребцов [12].
В последнее время появилось много научных работ, подтверждающих роль полиморфизма I/D гена ACE в развитии СД2 [14]. В ряде исследований установлено, что D-генотип связан с более высоким уровнем экспрессии ACE, что приводит к повышению уровня ангиотензина II, развитию метаболических нарушений, ИР и СД, сопровождающихся повышением уровня глюкозы в крови [15], в том числе при беременности [16]. Однако в литературе имеется и противоположное мнение: ряд авторов доказали непричастность полиморфизма гена ACE к возникновению СД [17]. Z. Dostalova и соавт. [18] уверены, что полиморфизм I/D гена ACE нельзя считать генетическим маркером ГСД.
Проведенный нами анализ распределения генотипов по гену АСЕ не выявил различий между беременными с ГСД и контрольной группой. В то же время мы обнаружили влияние полиморфизма гена АСЕ на концентрацию глюкозы у беременных с ГСД: у носителей генотипа I/I (7,46±1,35) она была достоверно выше, чем у пациенток с генотипами I/D (7,02±1,24) и D/D (7,23±0,61). Уровень HbA1c был максимально высоким при генотипах I/I и I/D (5,59±0,63 и 5,45±0,56%) по сравнению с D/D (5,19±0,48%). Кроме того, у новорожденных, матери которых были носителями генотипа I/I по гену АСЕ(3,9±2,52 ммоль/л), оказался максимальным уровень фруктозамина.
Наши результаты противоречат данным большинства исследователей [15, 16], уверенных в причастности к развитию сахарного диабета D-генотипа. В то же время наши выводы согласуются с мнением L. Carranza-Gonzalez и соавт. [19], что именно генотип I/I связан с высоким уровнем инсулина и ИР.
Учитывая тот факт, что ген АСЕ относится к разряду так называемых спортивных генов, мы согласны с заключением D.M. Davydov, M.K. Nurbekov [5], что при наличии генетической выносливости (генотипа I/I) у физически неактивных людей, в том числе беременных, избыток невостребованной глюкозы может появиться в плазме натощак. Следовательно, у неспортивных беременных с генотипом I/I по гену АСЕ повышается риск развития ГСД, во избежание которого им необходима физическая активность.
Переходя к оценке влияний на углеводный обмен другого гена DRD2, следует отметить, что он кодирует дофаминовый рецептор 2-го типа (D2), который располагается на поверхности дофаминергических нейронов, связан с G-белками и запускает каскад внутриклеточных реакций дофамина - ключевого гормона системы мотивации и вознаграждения [20]. В структуре DRD2 имеется значительное количество полиморфных локусов, среди которых наиболее изучен Taq1A (С32806Т, замена нуклеотидов С/Т, rs1800497). Он связан с развитием ряда нейропсихиатрических заболеваний, в первую очередь шизофрении [21, 22].
Другие авторы [23] установили связь между наличием аллеля DRD2 Taq1A (вариант Т) и риском развития СД2. B. Guigas и соавт. [24] идентифицировали DRD2 как ген восприимчивости к СД типа 2 у женщин. Нами подтверждено влияние полиморфизма Taq1A на уровень фруктозамина в крови у беременных с ГСД. У пациенток с генотипами С/Т (2,91±1,17) и Т/Т (3,02±0,62) этот показатель был достоверно выше, чем с генотипом С/С (2,36±0,45 ммоль/л).
Для объяснения полученной взаимосвязи между наличием локуса Taq1A и гипергликемией у беременных мы обратились к исследованиям ряда генетиков. Как выяснилось, полиморфизм Taq1A относится не к самому гену DRD2, а локализован рядом с ним в пределах другого гена - протеинкиназы PKK2 (Ankyrin Repeat And Kinase Domain Containing 1 -ANKK1) белка системы передачи пострецепторных внутриклеточных сигналов (современное обозначение локуса -DRD2/ANKK1 Taq1A) [20]. Кроме того, M. Heni и соавт. [25] установили взаимодействие между полиморфизмами гена ANKK1(TaqIA) и гена FTO (rs9939609), отвечающего за чувствительность к инсулину [26]. Передача сигнала по до-фаминергическому пути оказывает решающее воздействие на регуляцию чувствительности всего организма к инсулину. M. Heni и соавт. [25] сделали вывод, что взаимодействие FTO и ANNK1 влияет на метаболические и поведенческие сети мозга.
Следовательно, мы согласны с выводами D.M. Davydov, M.K. Nurbekov [5]: если у людей с высоким уровнем кортикального возбуждения, склонных к новизне и высокому уровню умственной деятельности (генотип A1A1 [Т/Т] гена DRD2), когнитивная активность снижается в течение длительного времени, избыток глюкозы остается невостребованным. Это могло вызывать рост уровня фруктозамина и приводить к развитию ГСД у наблюдаемых нами беременных.
Также нами проведен анализ полиморфизмов генов PGC1α, DRD2 и АСЕ у детей, рожденных у матерей с ГСД, в зависимости от наличия или отсутствия ДФ. Было установлено, что причастные к развитию ГСД аллели G (гена PGC1α), I (АСЕ) и Т (DRD2) реже встречались у детей с ДФ, чем без нее. Следовательно, эти аллели на внутриутробном этапе развития, вероятнее всего, выполняют защитную функцию.
В ходе нашего исследования выявлена взаимосвязь между полиморфизмом гена АСЕ новорожденного, а также уровнем фруктозамином пуповинной крови. Было установлено, что дети с диабетогенным генотипом I/I в пуповинной крови имели максимальные уровни фруктозамина (2,41±1,01 ммоль/л соответственно) по сравнению с носителями I/D и D/D, что подтверждает причастность I-содержащего аллеля к нарушениям углеводного обмена.
Заключение
Таким образом, полиморфизмы генов PGC1α, АСЕ и DRD2 причастны к нарушениям углеводородного обмена у беременных с ГСД, однако они не влияют на возникновение того или иного типа ГСД (инсулинопотребного или диетозависимого). У беременных-носителей генотипов GLy/GLy и I/I (по генам PGC1α и АСЕ соответственно) может развиться "спортивный" (периферический) ГСД, у носителей генотипа Т/Т (по гену DRD2) - "когнитивный" (центральный).
Полиморфизмы генов PGC1α, АСЕ и DRD2 матери не влияют на вероятность развития ДФ у ребенка. Тем не менее доказано негативное влияние "невостребованной" материнской глюкозы на метаболизм новорожденного. Поэтому можно предположить, что носителям генотипов GLy/GLy и I/I (по генам PGC1α и АСЕ соответственно) во избежание возникновения ГСД и его осложнений необходима физическая активность, носителям генотипа Т/Т (по гену DRD2) - познавательная деятельность и когнитивные нагрузки.
Персонифицированный подход позволит улучшить исходы беременности и нормализовать метаболизм у новорожденного. Однако целесообразно проведение дальнейших исследований для подтверждения подобных предположений. На развитие ДФ влияют полиморфизмы генов PGC1α, АСЕ и DRD2 плода: G-, I- и T-содержащие аллели генов соответственно защищают его от развития ДФ.
Благодарность. Авторы благодарят Малика Кубанычбековича Нурбекова, кандидата биологических наук, ведущего научного сотрудника лаборатории регуляции репаративных процессов ФГБНУ "Научно-исследовательский институт общей патологии и патофизиологии" (Москва).
Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.